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多重耐药的宋内志贺菌耐药机制和遗传多样性研究

作　者: 鲍春梅
导　师: 程云；曲芬
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 宋内志贺菌多重耐药 ESBLs CTX-M PFGE
分类号: R446.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

志贺氏菌是引起胃肠道感染主要病原菌之一,主要通过粪口途径传播,食物和水源污染是常见原因。全球每年发病人约为1.647亿,其中1.632亿发生在发展中国家,尤其在儿童、老人和免疫受损的病人中多发。死亡的110万人中有69%为5岁以下的儿童。志贺菌属分为A(痢疾志贺菌)、B(福氏志贺菌)、C(鲍氏志贺菌)、D(宋内志贺菌)四个群。发达国家流行的主要是宋内志贺菌,而发展中国家虽然长期以来流行的为福氏志贺菌,但近年来宋内志贺菌呈明显增加的趋势,并成为优势菌群。合理的抗生素治疗可减轻病情的严重程度、缩短病程且防止菌痢进一步传播。但同时也增加了对抗生素的耐药性,耐药性可通过接合转移等方式在不同细菌中水平传递,导致产酶菌的广泛耐药,包括对多种β-内酰胺类抗生素耐药;此外,也存在克隆的垂直传播。严重的耐药状况和复杂的耐药机制,给细菌性痢疾的临床治疗带来严峻的挑战。因此了解北京地区腹泻病原菌中宋内志贺菌的流行、耐药情况、耐药机制以及遗传差异的相关性,对本地区的流行耐药监测,指导临床合理用药,预防控制流行传播有着重要的意义。为此,我们做了以下研究:1.宋内志贺菌的分布特征、药敏试验及多重耐药菌的检测我们收集了自1990年1月-2007年12月我院就诊的腹泻患者中分离的1831株宋内志贺菌,用CLSI推荐的药敏琼脂纸片扩散法(Kirby- Bauer ,K-B法)检测13种抗生素的耐药率。在2004年-2007年间收集的212株宋内志贺菌中筛选出多重耐药菌43株,以氨苄西林耐药(ampicillin resistant, Am~R)、复方新诺明耐药(trimethoprim+Sulfamethoxazole resistant,Sxt~R)、头孢噻肟耐药(Cefotaxime resistant, Ctx~R)为主。用美国临床与实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的纸片确证试验检测超广谱β-内酰胺酶(Extend-Spectrumβ-Lactamases,ESBLs)、改良三维试验分别检测ESBLs和AmpC酶。1831株宋内志贺菌中,男女患者比例1.25:1;高发季节为7-9三个月;14岁以下的发病人数占总发病人数的57.82%;20岁以下的发病人数占总发病人数的71.64%。自2005年以来,宋内志贺菌在志贺菌属感染的比例明显升高。宋内志贺菌对复方新诺明、氨苄西林和头孢曲松的的耐药率较高,分别达到87.7%、23.0%和9.5%;对氟喹诺酮类、头孢吡肟、头孢美唑、氯霉素、磷霉素和庆大霉素的耐药率较低,分别为1.2%、2.5%、0.3%、3.7%、1.5%、1.7%,明显低于头孢曲松、头孢噻肟(P<0.05)。自2000-2007年间,氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟耐药率升高趋势明显。43株多重耐药菌占20.28%(43/212),均为ESBLs阳性株,并未发现产AmpC酶株,两种方法检测ESBLs符合率为100%。证明北京地区多重耐药的宋内志贺菌以产ESBLs为主。2.产ESBLs的宋内志贺菌耐药基因研究收集2004-2007年我院门诊腹泻病人分离的多重耐药(Am~R、Sxt~R、Ctx~R)宋内志贺菌43株,使用天津金章微量细菌定量的药敏测试盒产品检测氨苄西林、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、复方新诺明的MIC。分别用TEM型、SHV型、CTX-M1群、CTX-M2群、CTX-M8群、CTX-M9群、OXA、PER的ESBLs编码基因的通用引物和测序引物及1、2类整合子引物5,CS、3,CS和hep74、hep51对产ESBLs菌株进行扩增,并将菌株进行质粒结合实验。结果显示携带CTX-M基因27株,其中CTX-M1群16株,CTX-M9群11株,占所有阳性分离株的62.79%(27/43);携带TEM基因18株,占41.86%(18/43),未检出SHV、OXA、PER基因。其中同时携带CTX和TEM基因的10株,占23.26%(10/43);其中同时携带CTX-M1群、TEM基因的菌株有4株,占9.30%(4/43);同时携带CTX-M9群、TEM基因的菌株有6株,占13.95%(6/43)。95.35%(41/43)宋内志贺菌携带2类整合子,扩增片段大约在2000bp;1株携带1类整合子,扩增片段大约在1600bp。测序后经GenBank (www. ncbi. nlm. nih.gov)的blast比对,CTX-M1群以CTX-M-15like为主,1株为CTX-M-64,1株为CTX-M-15;CTX-M9群以CTX-M-14型为主,10株为CTX-M-14型,1株为CTX-M-27型;TEM全部为TEM-1型。MIC试验中,CTX-M-15like、CTX-M-15、CTX-M-27、CTX-M-64都表现出对头孢他啶不同程度的耐药,与氨基酸Asp240→Gly的替换有关。2类整合子普遍携带基因盒dfrA1, sat1, aadAl。1类整合子携带基因盒dfrA17, aadA5。质粒结合实验成功率为92.7%。北京地区产ESBLs宋内志贺氏菌以携带CTX-M基因为主,主要为CTX-M1群和CTX-M9群,其次为TEM型。耐药基因大多通过质粒水平转移的方式进行传播。流行亚型为CTX-M-15like、CTX-M-14和TEM-1。携带CTX-M-27或CTX-M-64的两株宋内志贺菌在国内未见报道。3.多重耐药宋内志贺菌的遗传相关性分析菌株用XbaⅠ限制性内切酶消化后进行PFGE分型,确定43株多重耐药的宋内志贺菌的亲缘关系,找出流行株及流行规律。多重耐药的宋内志贺菌的检出率从2004年的4.44%增长到2007年34.09%。43株多重耐药宋内志贺菌全部为宋内志贺氏菌I相。PFGE分型结果显示97. 6%(40/41)的为流行株。在北京地区至少有A～A5六个克隆株流行,分别占39.0%(16/41)、24.4%(10/41)、17.1%(7/41)、7.3%(3/41)、4.9%(2/41)、4.9%(2/41)。A1、A2、A3、A4、A5与流行株A的条带差异分别为1、2、2、3、4条。2006年以A和A1型为主,2007年以A型为主。A1型以携带CTX-M-15Like耐药基因为主,A3型以TEM-1为主。北京地区多重耐药的宋内志贺菌存在克隆株的传播。根据以上三个部分的研究,初步可以得出如下结论:北京地区宋内志贺菌感染以儿童及青少年为主,在志贺菌属感染的比例有增高的趋势。宋内志贺菌对头孢曲松、头孢噻肟、复方新诺明、氨苄西林的耐药率较高,且有上升趋势。多重耐药的宋内志贺氏菌有逐年上升的趋势,它的耐药机制以产ESBLs为主,未发现AmpC酶。ESBLs进一步分型以携带CTX-M型ESBLs为最多,其中以CTX-M-14、CTX-M-15like、TEM-1最为常见,部分菌株携带两种耐药基因。耐药基因大多通过质粒水平转移的方式进行传播。多数菌株携带2类整合子。携带CTX-M-27或CTX-M-64的宋内志贺菌在国内未见报道。多重耐药宋内志贺菌的97.6%为流行株。耐药宋内志贺菌存在耐药基因的水平传播,也有克隆株的垂直传播,应加强监控,指导临床正确防治。

全文目录

英文缩略词表  4-5
中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
前言  12-18
  1. 宋内志贺菌流行趋势  12
  2. 宋内志贺菌耐药状况  12-13
  3. 常见耐药机制  13-16
  4. 常见耐药机制检测方法  16-18
第一部分宋内志贺菌的流行、药敏试验及多重耐药菌的检测  18-25
  引言  18
  材料与方法  18-20
  结果  20-24
  讨论  24
  小结  24-25
第二部分多重耐药的宋内志贺菌耐药基因研究  25-38
  引言  25
  材料与方法  25-29
  结果  29-36
  讨论  36-37
  小结  37-38
第三部分多重耐药的宋内志贺菌的遗传相关性分析  38-46
  引言  38
  材料与方法  38-42
  结果  42-44
  讨论  44-45
  小结  45-46
结论  46-47
参考文献  47-53
综述  53-62
个人简历  62-63
致谢  63

多重耐药的宋内志贺菌耐药机制和遗传多样性研究

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