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多肽介导脑胶质瘤靶向纳米基因给药系统

作　者: 柯伟伦
导　师: 蒋晨
学　校: 复旦大学
专　业: 药剂学
关键词: CTX Angiopep 聚酰胺-胺纳米粒血脑屏障基因治疗基质金属蛋白酶-2 低密度脂蛋白受体相关蛋白脑胶质瘤
分类号: R739.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

脑胶质瘤是发病率最高的脑肿瘤,也是死亡率最高的10类肿瘤之一。由于脑胶质瘤自身的浸润性生长特点以及血脑屏障(BBB)的存在,使得目前常用的治疗手段包括手术切除、放疗、化疗等均难以达到良好的治疗效果。基因治疗是一种极具潜力的治疗手段,但是基因药物难以自主向胶质瘤富集,需要构建具有主动靶向性质的基因药物递释系统,使得外源性基因药物在病灶部位实现广泛表达。本课题针对脑胶质瘤生长过程中BBB的生理特点,设想两种构建基因药物递释系统的策略：(1)在脑胶质瘤晚期,BBB受到破坏,此时脑胶质瘤与其他肿瘤类似,具有EPR效应,在此基础上采用胶质瘤靶向头基修饰则能进一步提高药物在胶质瘤细胞内的浓集；(2)在脑胶质瘤早期,BBB保持完整,选用对BBB、胶质瘤细胞高亲和性多肽作为靶向头基可能实现跨越BBB、靶向胶质瘤。基于以上两种策略,本课题通过药剂学、高分子学和生物学手段的交叉应用,以阳离子高分子聚酰胺-胺(PAMAM)为基础载体高分子,通过亲水性高分子聚乙二醇(PEG)连接胶质瘤靶向多肽CTX或BBB-胶质瘤双靶向多肽Angiopep,与基因复合形成PAMAM-PEG-CTX/DNA和PAMAM-PEG-Angiopep/DNA纳米粒。这两种纳米给药系统具有以下特征：(1)所采用的基因载体PAMAM是近年发展起来的新型阳离子高分子材料,易于修饰,载基因能力较高；(2)选用的CTX是一段特异性与胶质瘤细胞结合的多肽,能提高纳米粒的胶质瘤靶向性；(3)选用的Angiopep是一段与BBB和胶质瘤细胞均具有高亲合力的多肽,能够协助纳米粒穿越BBB后进一步向胶质瘤细胞浓集。本文第一章对脑胶质瘤的生理特点及治疗手段进行了概述。脑胶质瘤作为颅内最常见且最难治愈的疾病,除了具有一般肿瘤的基本特征外,还有自身的特点,主要表现为浸润性生长和“韭菜样”再生增殖的特点。随着肿瘤生成过程中肿瘤细胞与星形细胞以及内皮细胞的相互作用,血脑屏障逐渐受到破坏。目前脑胶质瘤常用的治疗手段包括手术切除、放疗和化疗,但是各自存在缺点且疗效不佳。基因治疗是极具潜力的新型治疗手段。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand, TRAIL)是最近发现的介导细胞凋亡的信号分子,具有TNF家族成员的许多特性,能够特异性与胶质瘤细胞表面受体结合诱导凋亡,但不杀伤正常细胞。本研究采用编码TRAIL蛋白的质粒pORF-TRAIL作为基因药物,以PAMAM为基础载体,针对脑胶质瘤生长过程中BBB的生理特点,采取胶质瘤靶向和BBB-胶质瘤双靶向两种策略构建出两种基因药物递释系统。分别选用CTX和Angiopep两段多肽为靶向头基,其中CTX能通过与胶质瘤细胞高量表达的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)结合形成MMP-2-CTX复合物后被胶质瘤细胞特异性摄取,具有胶质瘤靶向作用；而Angiopep则是通过胶质瘤细胞和BBB上均表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)介导进入细胞,从而实现BBB-胶质瘤双靶向。本文第二章第一节对PAMAM-PEG-CTX高分子载体及其载基因纳米粒的体外性质进行了评价。CTX修饰后能特异性增加载体高分子在C6胶质瘤细胞上的摄取,而在正常细胞(293细胞)上的摄取则不受影响。载体高分子在C6细胞上的摄取在4℃时受到抑制,说明载体可能通过内吞途径进入细胞。CTX修饰后的载基因纳米粒在C6细胞的摄取也明显增加。第二节考察了PAMAM-PEG-CTX/DNA载基因纳米粒在荷脑胶质瘤小鼠的体内分布、脑内表达,并对纳米粒治疗脑胶质瘤进行了药效学评价。与未修饰的PAMAM/DNA纳米粒相比,PAMAM-PEG-CTX/DNA能够增加纳米粒在荷脑胶质瘤小鼠肿瘤部位的聚集。冰冻切片结果显示,PAMAM-PEG-CTX/DNA纳米粒在胶质瘤边缘部位的肿瘤组织有较明显的表达,而PAMAM/DNA则在胶质瘤边缘部位的正常组织部分有少量表达,这可能与肿瘤的新生血管与血脑屏障相关。药效学评价结果显示,PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL纳米粒能够诱导荷瘤小鼠脑胶质瘤内部的肿瘤细胞凋亡,效果与市售的口服药物替莫唑胺相当,而PAMAM/pORF-TRAIL则能在胶质瘤边缘引发细胞凋亡PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL和替莫唑胺组的荷瘤小鼠中位存活时间分别为59.5天和49天,且PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL组50%的小鼠存活时间超过70天,而替莫唑胺组的存活时间均小于70天。以上结果说明PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL能有效治疗脑胶质瘤。第三章第一节对PAMAM-PEG-Angiopep高分子载体及其载基因纳米粒的体内外性质进行了评价。Angiopep修饰后能够增加载体在脑毛细血管内皮细胞(BCECs)上的摄取,并且在一定范围内呈现出浓度依赖性。摄取机理考察结果显示,PAMAM-PEG-Angiopep载体高分子及其载基因纳米粒可能通过LRP介导的内吞途径被BCECs摄取。Angiopep修饰后能提高载基因纳米粒跨BCECs单层的转运效率。体内分布结果显示,Angiopep修饰能增加载基因纳米粒的脑内分布,且随Angiopep修饰的比例上升而增加；同时,Angiopep的修饰能够有效增加外来基因在小鼠脑内各部位的表达效率。PAMAM-PEG-Angiopep/DNA载基因纳米粒显示出良好的脑靶向效率。第二节考察了PAMAM-PEG-Angiopep/DNA载基因纳米粒在荷脑胶质瘤小鼠的体内分布,并对纳米粒治疗脑胶质瘤进行了药效学评价。与未修饰的PAMAM/DNA纳米粒相比,PAMAM-PEG-Angiopep/DNA能够增加纳米粒在荷脑胶质瘤小鼠肿瘤部位的聚集,可能的原因是纳米粒在Angiopep介导穿越BBB后进一步向胶质瘤细胞浓集,显示出BBB-胶质瘤双靶向作用。药效学评价结果显示,PAMAM-PEG-Angiopep/pORF-TRAIL纳米粒能够诱导荷瘤小鼠脑胶质瘤内部的肿瘤细胞凋亡；PAMAM-PEG-Angiopep/pORF-TRAIL和替莫唑胺组的荷瘤小鼠中位存活时间分别为56.5天和49天,二者的整体存活时间相当。以上结果说明PAMAM-PEG-Angiopep/pORF-TRAIL是一种能有效治疗脑胶质瘤的非病毒基因药物递释系统。

多肽介导脑胶质瘤靶向纳米基因给药系统

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