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秦岭山区中国林蛙致病菌的分离鉴定

作　者: 孟岳峰
导　师: 孙燕
学　校: 陕西师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 中国林蛙 致病菌 变性梯度凝胶电泳 细菌群落结构
分类号: S947.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 58次
引　用: 1次
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内容摘要


两栖类动物不仅在维持生态平衡、控制害虫等方面有重要作用,而且有重要的经济和药用等价值。中国林蛙作为中国特有的两栖类物种,也具有上述重要价值。然而近年来随着人类活动造成的环境破坏和人为的过度捕捉,中国林蛙的种群数量急剧下降。野外考查中发现中国林蛙(Rana chensinensis)广泛分布于秦岭山区,而分布在大峪口(A地,10906’52"E,34°0’56"N)的个体较石砭峪(B地,108°56’33"E,3400’20"N)的个体易患病死亡。本实验从A地患病中国林蛙体内分离到6株条件致病菌,用传统的生理生化实验和16SrDNA序列分析方法对分离到的细菌进行鉴定,分离到的菌株分别为约翰逊不动杆菌、假单胞菌、摩氏摩根菌、红串红球菌、黄杆菌、和嗜水气单胞菌。经回归感染证实,其中嗜水气单胞菌对中国林蛙有强致病性,而约翰逊不动杆菌和红串红球菌可增强嗜水气单胞菌对中国林蛙的致病性,说明分布在大峪口的中国林蛙患病确实是由细菌感染所引起的。用PCR-DGGE (PCR-denaturing gradient gel electrophoresis)技术对两地细菌群落结构进行比较分析,结果显示,A、B两地土壤和水体中的细菌种类多样性都很高,但存在明显差异：A地水体中的微生物群落结构明显不同于其它环境,可能是受人类活动影响较大,导致细菌群落结构发生了较大变化。同时对从患病中国林蛙体内分离到的6种菌株在两地分布及含量进行研究,结果显示,对中国林蛙有强致病性的嗜水气单胞菌在A地含量明显高于B地,可增强嗜水气单胞菌对中国林蛙致病性的约翰逊不动杆菌在A地含量也高于B地；且A地含量较高的细菌与来自于生活污水的菌株同源性最高,对人和动物有致病性。由此推断环境中微生物种群差异、以及同种微生物在两地种群中含量的不同是导致野生林蛙患病的主要原因。经考查发现A地环境受人类活动影响较大,水源附近有大量生活垃圾,水样经陕西省水文水资源勘测局检测,发现A地水质明显比B地水质差。因此A地环境中的污染物可能降低中国林蛙的免疫力,从而使中国林蛙易染病死亡,也可能是各种因素共同对中国林蛙作用的结果,但这些因素都是人类活动所引起的,所以要更好地保护野生中国林蛙资源,就要减少人类对环境的干扰和破坏。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-10
第1章 前言  10-30
  1.两栖类简介  10-17
    1.1 两栖类动物的分类与特征  10
    1.2 两栖类的价值  10-12
      1.2.1 两栖类是世界动物资源的重要组成部分  10-11
      1.2.2 两栖类具有重大的药用价值  11
      1.2.3 两栖类是重要的环境指示动物和科研动物  11-12
    1.3 两栖类动物种群衰退及其原因  12-17
      1.3.1 人类活动所引起的生境破坏与丧失  12-13
      1.3.2 人为的过度捕捉  13-14
      1.3.3 环境污染  14
      1.3.4 紫外线辐射  14-15
      1.3.5 外来物种入侵  15-16
      1.3.6 气候变化  16
      1.3.7 病菌感染  16-17
  2.中国林蛙  17-20
    2.1 中国林蛙的特点、分布及价值  17-19
      2.1.1 中国林蛙的特点  17-18
      2.1.2 中国林蛙的分布  18
      2.1.3 中国林蛙的价值  18-19
    2.2 中国林蛙的研究现状  19-20
  3.细菌鉴定  20-22
    3.1 传统的细菌鉴定方法  20-21
      3.1.1 形态学鉴定  20
      3.1.2 生理生化鉴定  20-21
      3.1.3 细菌的自动化鉴定  21
      3.1.4 化学分类归类  21
    3.2 新型细菌鉴定方法  21-22
  4.细菌群落结构的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析  22-27
    4.1.DGGE技术的原理  23-24
    4.2 操作步骤  24
    4.3 DGGE技术的关键环节和系统优化  24-26
      4.3.1 样品中细菌总DNA的提取  24-25
      4.3.2 16S rDNA片段的PCR扩增  25
      4.3.3 凝胶浓度和最佳变性剂梯度的确定  25-26
      4.3.4 电泳温度与时间的确定  26
    4.4 DGGE技术的应用  26-27
    4.5 DGGE技术的缺陷  27
  5.研究意义和目的  27-30
第2章 秦岭山区中国林蛙致病菌的分离鉴定  30-44
  1.引言  30
  2.材料与方法  30-37
    2.1 实验材料  30-33
      2.1.1 实验动物  30
      2.1.2 主要试剂  30-31
      2.1.3 培养基  31-32
      2.1.4 仪器  32-33
    2.2 病蛙检查  33
    2.3 病菌的分离  33
    2.4 中国林蛙回归感染实验  33
    2.5 细菌部分16S rDNA序列分析  33-35
      2.5.1 细菌基因组DNA的提取  33-34
      2.5.2 细菌部分16S rDNA序列的扩增  34-35
      2.5.3 16S rDNA序列分析  35
    2.6 病原菌的形态学观察及生理生化试验  35-37
      2.6.1 形态学观察  35
      2.6.2 生理生化特性实验  35-37
  3.结果与分析  37-42
    3.1 染病中国林蛙检查结果  37-38
    3.2 病菌的分离  38
    3.3 回归感染实验  38-39
    3.4 菌株的形态学观察  39
    3.5 菌株的16S rDNA序列分析  39-41
      3.5.1 各菌株的基因组DNA提取  39
      3.5.2 各菌株16S rDNA部分片段的扩增  39-40
      3.5.3 细菌16S rDNA序列测定与分析  40-41
    3.6 菌株的生理生化实验结果  41-42
  4.讨论  42-44
第3章 中国林蛙不同生境中的微生物群落结构分析  44-66
  1.引言  44
  2.材料与方法  44-55
    2.1 材料  44-47
      2.1.1 土壤及水体样品  44-45
      2.1.2 试剂及缓冲液的配制  45-47
      2.1.3 培养基  47
      2.1.4 仪器  47
    2.2 样品中基因组DNA的提取  47-49
      2.2.1 土壤样品中细菌基因组总DNA的提取  47-48
      2.2.2 水体中细菌基因组总DNA的提取  48-49
    2.3 样品中细菌16S rDNA序列的巢式PCR扩增  49-51
      2.3.1 细菌16S rDNA巢式PCR第一轮扩增  49-50
      2.3.2 细菌16S rDNA巢式PCR第二轮扩增  50
      2.3.3 PCR产物纯化  50-51
    2.4 细菌16S rDNA序列的DGGE分析  51-53
      2.4.1 DGGE垂直变性梯度凝胶电泳  51-53
      2.4.2 DGGE平行变性梯度凝胶电泳  53
    2.5 DGGE图谱分析  53
    2.6 DGGE图谱中特异性条带的回收及序列分析  53-55
      2.6.1 DGGE图谱中特异条带的切割回收  53-54
      2.6.2 切割条带的PCR扩增  54
      2.6.3 PCR扩增产物的DGGE分离  54
      2.6.4 回收片段的克隆  54-55
      2.6.5 克隆的筛选  55
      2.6.6 DGEE图谱中特异性条带的序列分析  55
  3. 结果与分析  55-63
    3.1 样品中细菌基因组总DNA的提取  55-56
    3.2 细菌16S rDNA序列扩增  56-58
      3.2.1 细菌16S rDNA巢式PCR第一轮扩增  56-57
      3.2.2 细菌16S rDNA巢式PCR第二轮扩增  57
      3.2.3 PCR扩增产物的纯化  57-58
    3.3 细菌16S rDNA序列的DGGE分析  58-60
      3.3.1 DGGE垂直变性梯度凝胶电泳  58
      3.3.2 DGGE平行变性梯度凝胶电泳  58-59
      3.3.3 DGGE图谱的Quantity One软件分析  59-60
    3.4 DGGE图谱中特异性条带的回收,克隆及序列分析  60-63
      3.4.1 回收条带的DGGE筛选  60-61
      3.4.2 回收条带克隆的菌落PCR筛选  61-62
      3.4.3 回收条带克隆的DGGE筛选  62-63
      3.4.4 回收条带的序列分析  63
  4. 讨论  63-66
总结  66-68
参考文献  68-74
致谢  74-76
攻读硕士学位期间研究成果  76-77

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 其他水产病虫害及其防治 > 蛙病及其防治
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