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鳗鲡致病菌快速诊断试剂盒的研制及流行规律调查

作　者: 韩金钢
导　师: 关瑞章
学　校: 集美大学
专　业: 水生生物学
关键词: 鳗鲡致病菌免疫抗血清疾病流行规律
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

鳗鲡是中国重要的养殖经济鱼类,自70年代末以来,很快发展成为中国出口创汇最多的单项水产品之一。目前中国大陆的主要养殖品种有日本鳗鲡、欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡。随着养殖集约化程度的提高,养殖环境日益恶化,鳗鲡病害成为困扰鳗鲡养殖业持续、健康发展的重要因素,尤其是细菌性病害,发病广、传播快、死亡率高,给鳗鲡养殖业者造成了巨大的经济损失。因此,快速的诊断疾病是有效防治的关键,但是目前对鳗鲡致病菌的快速诊断试剂盒的研究缺乏,对鳗鲡细菌病害的流行规律调查也甚少。鉴于此,本试验研制了15株主要鳗鲡致病菌免疫血清,并和实验室以往研制的20株主要鳗鲡致病菌免疫血清,制成35种快速诊断试剂盒,对鳗鲡主产区福建省不同养殖种类、不同季节、不同地区、不同规格的患病鳗鲡进行了检测,主要结果如下:1.抗血清的制备。本试验采用静脉注射免疫法制备了15株鳗鲡致病菌的兔抗血清,并应用玻片凝集法对血清效价进行测定,结果显示:7株菌的抗血清效价达到2048,占46.7 % ;3株达到10~24,占20 %;3株达到512,占20 %;2株达到256,占13.3%。2.抗血清交叉反应去除。采用玻片凝集法测定了每种免疫血清与其它34株鳗鲡致病菌(与血清对应的致病菌株除外)的交叉反应效价,并采用非特异性吸附沉淀法对存在交叉反应的血清进行了交叉去除,结果显示:具有明显交叉反应的血清有15种,占42.9 %;其中9种通过非特异性吸附沉淀法可完全去除,占存在交叉反应血清总数的60 %,且7种去除交叉后的血清效价没有下降,2种效价降低了1倍,去除交叉后的血清具有较高的效价和特异性;其余6种不能完全去除交叉反应的血清,在实际检测时可通过稀释血清使交叉反应不明显。3.抗血清的检测灵敏度。采用玻片凝集法测定了35种血清的检测灵敏度,结果显示:检测灵敏度在1×10~8 cfu/mL以上的24种, 1×10~7 cfu/mL以上的9种, 1×10~6 cfu/mL以上的2种。4.应用乳胶凝集实验方法检测鳗鲡致病菌的研究。为了提高试剂盒检测灵敏度,防止漏检,本试验在玻片凝集试验的基础上对乳胶凝集试验条件进行了探索。应用A蛋白亲和层析纯化后的抗体(S18和S31)致敏乳胶,并设计了不同偶联时间、抗体加入量、致敏时间和封闭时间的乳胶致敏效果对比试验,结果表明:碳化二亚胺(EDC)偶联3 h,加入纯化抗体量588.6μg/ml(S18); 568.7μg/ml(S31),25℃、200 r/min致敏10~ h,然后加入甘氨酸于25℃、200 r/min封闭30 min,得到的致敏乳胶抗体与对应抗原反应效价最高,达到512,抗原检测灵敏度最高,达到1×10~6 cfu/mL,且特异性强,重复性好,4℃保存4个月效价不变,室温保持1个月效价不变。乳胶凝集试验方法较直接玻片凝集法检测灵敏度高,但检测成本高于玻片凝集。5.不同种类鳗鲡致病菌检测结果:3种养殖鳗鲡共检测到致病菌28株,共同的致病菌主要是嗜水气单胞菌,鳗弧菌主要感染欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡。11株鳗鲡致病菌分别仅在一种鳗鲡中检出,其中欧洲鳗鲡、日本鳗鲡、美洲鳗鲡分别占5株、4株和2株,说明相当数量的致病菌具有种类特异性。6.不同季节鳗鲡致病菌检测结果:3个季节共检测到28株致病菌,8株全年流行,嗜水气单胞菌是全年最主要的致病菌,但在不同季节检测到的具有血清型差异。13株致病菌在单一季节出现,包括春季7株,夏季4株,秋季2株,显示了较强的季节特异性。春季主要致病菌是酸克雷伯氏菌、嗜水气单胞菌(血清Ⅲ型,B18)和温和气单胞菌;夏季主要嗜水气单胞菌(血清Ⅱ,B15)和鳗弧菌;秋季以嗜水气单胞菌(血清Ⅷ型,B31)为主。7.不同地区鳗鲡致病菌检测结果:检测到28株鳗鲡致病菌,其中嗜水气单胞菌(不同血清型)分布范围广,在4个地区均出现,鲁氏耶尔森菌和霍利斯弧菌只在闽南出现,迟钝爱德华氏菌和溶解阴沟肠杆菌流行于闽西;10~株在2个不同地方同时检出;9株致病菌菌仅在单一地区出现,说明部分鳗鲡致病菌具有地域差异。8.不同规格鳗鲡致病菌检测结果:从5个规格共检测到28株鳗鲡致病菌,其中8株在所有规格都能检出,共同的主要致病菌为不同血清型的嗜水气单胞菌、鳗弧菌和威隆气单胞菌温和生物变种;7株在单一规格检测到的致病菌中有5株出现在10~g以下的鳗鲡,它们是鲁氏耶尔森菌、霍利斯弧菌、腐败希瓦菌、1株非发酵菌和1株未鉴定结果的菌(B34),鳗弧菌主要危害10~-50g的鳗鲡,50g以上的鳗鲡以感染嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌为主,溶解阴沟肠杆菌唯一在200g以上的鳗鲡中检出。说明一些致病菌具有种类差异。本研究结果表明:静脉注射鳗鲡致病菌免疫新西兰大白兔可以制备高效价的免疫血清,而非特异性吸附法能够对大多数存在交叉反应的血清进行交叉去除,去除交叉后的免疫血清诊断试剂盒特异性高,检测快速、操作简便,可以在现场对鳗鲡致病菌进行准确检测。不同血清型的嗜水气单胞菌是三种主要养殖鳗鲡的主要致病菌,本研究结果初步揭示了养殖鳗鲡的主要致病菌具有一定的种类、季节、地区和规格的特异性。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第1章绪论  12-27
  1.1 养殖鱼类疾病的研究进展  12-16
  1.2 养殖鳗鲡主要疾病的研究现状  16-21
    1.2.1 寄生虫性疾病  16-18
    1.2.2 主要病毒性疾病  18
    1.2.3 真菌性及其他疾病  18
    1.2.4 主要细菌性疾病  18-21
  1.3 鱼类细菌性疾病检测技术研究现状  21-24
    1.3.1 传统检测技术  21-22
    1.3.2 免疫诊断技术  22-23
    1.3.3 分子生物学技术  23-24
    1.3.4 PCR 与免疫学技术的结合应用  24
  1.4 本研究的背景、意义及内容  24-27
    1.4.1 研究背景  24-26
    1.4.2 研究意义  26
    1.4.3 研究内容  26-27
第2章鳗鲡致病菌兔抗血清的研制  27-42
  2.1 材料与方法  27-31
    2.1.1 材料  27-29
    2.1.2 实验方法  29-31
  2.2 结果  31-38
    2.2.1 免疫后不同时间的血清效价变化  31-33
    2.2.2 玻片凝集检测方法与判断标准  33-34
    2.2.3 新制备15 种免疫血清的交叉凝集效价  34
    2.2.4 非特异性吸附沉淀去除血清交叉反应  34-36
    2.2.5 血清最佳工作浓度与对应菌反应灵敏度的测定  36-38
  2.3 讨论与小结  38-42
    2.3.1 讨论  38-41
    2.3.2 小结  41-42
第3章应用抗血清检测鳗鲡致病菌方法的研究  42-63
  3.1 材料和方法  42-50
    3.1.1 材料  42-45
    3.1.2 方法  45-50
  3.2 结果  50-59
    3.2.1 致病菌  50-51
    3.2.2 葡萄球菌 A 蛋白亲和层析纯化 IgG  51-52
    3.2.3 血清蛋白含量的测定  52-53
    3.2.4 间接Elisa 法测定两种兔抗血清纯化前后的效价  53-54
    3.2.5 免疫血清纯化后 SDS-PAGE 电泳  54-55
    3.2.6 羧化乳胶致敏最佳条件的确定  55-56
    3.2.7 羧化乳胶最佳工作浓度  56-57
    3.2.8 羧羧化乳胶的的检测灵灵敏度  57-58
    3.2.9 羧化乳胶的特异性试验  58
    3.2.10 羧化乳胶的重复性试验  58-59
  3.3 讨论与小结  59-63
    3.3.1 讨论  59-61
    3.3.2 小结  61-63
第4章鳗鲡致病菌的现场检测与流行规律调查  63-91
  4.1 材料和方法  63-65
    4.1.1 材料  63
    4.1.2 方法  63-65
  4.2 结果  65-87
    4.2.1 检测地区及鳗场基本情况  65-67
    4.2.2 不同种类鳗鲡检测  67-68
    4.2.3 不同季节鳗鲡致病菌检测  68-70
    4.2.4 不同地区鳗鲡致病菌检测  70-72
    4.2.5 不同规格鳗鲡致病菌检测  72-74
    4.2.6 欧洲鳗鲡致病菌检测  74-79
    4.2.7 日本鳗鲡致病菌检测  79-84
    4.2.8 美洲鳗鲡致病菌检测  84-87
  4.3 讨论与小结  87-91
    4.3.1 讨论  87-89
    4.3.2 小结  89-91
第5章总结与展望  91-95
  5.1 主要成果与创新之处  91-93
    5.1.1 主要成果  91-93
    5.1.2 创新之处  93
  5.2 展望  93-95
致谢  95-96
参考文献  96-102
在学期间发表或撰写学术论文  102

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