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牛骨胶原多肽的制备及其清除自由基活性研究

作　者: 王晨
导　师: 吴晖
学　校: 华南理工大学
专　业: 食品质量与安全
关键词: 酶解牛骨胶原多肽清除自由基活性
分类号: TS201.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

近年来,由于化学抗氧化剂存在的安全性问题,高效、低毒的天然食品抗氧化剂的研制日益成为人们的关注热点。目前,关于具有抗氧化活性的胶原多肽的研究多集中于水产品及动物皮肤中,对于动物骨骼来源尤其是牛骨来源的胶原多肽的研究较少。本文首次研究了牛骨胶原蛋白的酶法提取工艺,并探讨了各种反应条件对牛骨胶原蛋白酶解反应的影响规律,揭示了该酶解反应的动力学特性,优化了牛骨胶原多肽的酶法制备工艺;此外,首次研究了牛骨胶原多肽的抗氧化活性,并对具有最佳清除自由基活性的牛骨胶原多肽特性进行了表征分析。以牛骨为原料,进行酶法提取牛骨胶原蛋白的最佳前处理工艺为:原料用正己烷脱脂,用5倍质量的0.25mol/L EDTA脱钙处理2d。经前处理后的牛骨粉酶法提取的最佳工艺条件为:使用胃蛋白酶,加酶量30mg/g、pH值1.7、37℃条件下处理120min,然后在液固比6:1的情况下用水抽提5h。在上述条件下,牛骨胶原蛋白及其多肽的提取率可达9.93%。所得产物的平均分子量为10250,是由含有75个左右的氨基酸的多种多肽组成。选取六种蛋白酶对提取的胶原蛋白及其多肽进行进一步的水解,在所研究的六种蛋白酶中,碱性蛋白酶催化牛骨胶原蛋白所得到的水解度最高,为12.83%,其次是胰蛋白酶,水解度为9.49%。而复合蛋白酶和风味蛋白酶则水解效果较差,水解度仅为4.21%和6.32%。碱性蛋白酶Alcalase 2.4L水解牛骨胶原蛋白的最佳条件在pH值8.5,60℃,底物浓度为80g/L,加酶量为40μL/g,反应时间3h。在上述条件下,酶促牛骨胶原蛋白水解反应的水解度可达13.5%。对该反应的动力学特征研究表明,该酶解反应的Km为1.6362 mol/L,Vmax为0.3444 mol/L·h,为更有效地利用胶原蛋白资源奠定了理论基础。经碱性蛋白酶Alcalase 2.4L催化制备的牛骨胶原多肽具有较高的清除自由基活性。且其清除自由基活性与酶解反应的水解度之间存在关联关系。根据其对羟基自由基、超氧阴离子自由基、二苯代苦味酰基自由基清除能力,以及还原能力、脂质抗氧化能力等抗氧化活性指标的测定结果,确定了水解度为7.9%左右的胶原多肽清除自由基的综合效果最好。在80g/L的浓度下,其对超氧阴离子(O2-·)的清除率为63.86%,对羟基自由基(·OH)的清除率为99.55%,对二苯代苦味酰基自由(DPPH·)的清除率为27.03%,对大豆卵磷脂过氧化作用的抑制率为74.78%。具有最高综合抗氧化活性的牛骨胶原多肽的含氮化合物含量可以达到93.1%,其活性成分占酶解产物质量的78.3%,活性成分的平均分子量为2025Da,为含15个左右氨基酸的多肽。对其氨基酸组成进行分析发现,含有清除自由基基团的几种氨基酸如脯氨酸、谷氨酸等的含量均高于10%,表明其组成符合清除自由基原理及胶原蛋白的氨基酸比例。酶解反应水解度与产物肽分子量之间呈现较好的线性关系,即产物肽的分子量随着反应水解度增加而递减。所得到的线性方程为:y=-813.1x+9754.4,R2=0.9696,其中x为酶解反应水解度,y为产物分子量。呈现了很好的线性相关,可以作为今后研究牛骨胶原蛋白水解的基础。本研究不但具有一定的学术价值,还具有重要的实践意义。在理论上,牛骨胶原蛋白酶解及产物特性的研究深化了对天然产物降解过程特性、酶选择性、产物结构功能变化等关键理论知识的认识,在应用上,本研究有助于促进安全、绿色的新型抗氧化剂的研发,以解决目前化学合成抗氧剂在食品领域滥用引起的食品安全问题。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-14
第一章绪论  14-29
  1.1 胶原蛋白的研究进展  14-18
    1.1.1 胶原蛋白的概述  14
    1.1.2 胶原蛋白的结构  14-16
    1.1.3 胶原,明胶及水解胶原蛋白  16-17
    1.1.4 胶原蛋白的应用进展  17-18
  1.2 胶原蛋白活性肽  18-22
    1.2.1 抑制血管紧张素转化酶活性  19
    1.2.2 抑制血小板凝集活性  19-20
    1.2.3 抗氧化活性  20
    1.2.4 抗肿瘤活性  20-21
    1.2.5 水解胶原多肽的制备方法  21-22
  1.3 抗氧化活性肽及其作用机理自由基及去自由基机理  22-26
    1.3.1 自由基及去自由基机理  22
    1.3.2 抗氧化活性肽的作用机理  22-24
    1.3.3 抗氧化肽的种类及其抗氧化机理研究进展  24-25
    1.3.4 抗氧化肽的制备方法  25-26
  1.4 本课题的研究意义和主要内容  26-29
    1.4.1 本课题的研究意义  26-27
    1.4.2 本课题的研究内容  27-29
第二章提取牛骨胶原蛋白及其多肽工艺的研究  29-38
  2.1 引言  29
  2.2 材料与方法  29-30
    2.2.1 试验材料  29
    2.2.2 主要仪器设备  29-30
  2.3 工艺流程  30-31
    2.3.1 牛骨脱脂处理方法  30
    2.3.2 牛骨脱钙处理方法  30
    2.3.3 牛骨去除杂蛋白处理方法  30-31
    2.3.4 牛骨酶解提取方法  31
    2.3.5 抽提  31
    2.3.6 牛骨胶原蛋白粗提物蛋白质含量分析  31
  2.4 结果与分析  31-36
    2.4.1 不同的前处理处理方式对牛骨胶原蛋白及多肽提取的影响  31
    2.4.2 脱脂剂的选择  31-32
    2.4.3 脱钙剂的选择  32
    2.4.4 酶处理条件对牛骨胶原蛋白及其多肽提取的影响  32
    2.4.5 酶解pH值对牛骨胶原蛋白及其多肽提取的影响  32-33
    2.4.6 酶酶解温度对牛骨胶原蛋白及其多肽提取的影响  33
    2.4.7 酶解时间对牛骨胶原蛋白及其多肽提取的影响  33-34
    2.4.8 酶法提取牛骨胶原蛋白及其多肽正交实验结果  34-35
    2.4.9 固液比对牛骨胶原蛋白及其多肽提取率的影响  35-36
    2.4.10 抽提时间对牛骨胶原蛋白及其多肽提取率的影响  36
    2.4.11 牛骨胶原蛋白粗提物蛋白质含量  36
    2.4.12 产物平均分子量  36
  2.5 本章小结  36-38
第三章牛骨胶原多肽的制备及其动力学研究  38-47
  3.1 引言  38
  3.2 材料与仪器  38-39
    3.2.1 主要仪器  38
    3.2.2 材料与试剂  38-39
  3.3 试验方法  39-40
    3.3.1 酶的筛选  39
    3.3.2 酶解条件对水解度的影响  39-40
    3.3.3 米氏常数Km 和最大反应速度Vmax 的测定  40
    3.3.4 最适酶解工艺条件的确立  40
  3.4 结果与分析  40-46
    3.4.1 蛋白酶种类对牛骨胶原蛋白水解反应的影响  40-41
    3.4.2 反应条件对Alcalase 2.4L催化牛骨胶原蛋白水解反应的影响  41-44
    3.4.3 米氏常数Km 和最大反应速度Vmax 的测定  44
    3.4.4 最适酶解工艺条件的确立  44-46
  3.5 本章小结  46-47
第四章牛骨胶原多肽体外清除自由基活性的研究  47-57
  4.1 引言  47
  4.2 材料与仪器  47-48
    4.2.1 主要仪器  47
    4.2.2 材料与试剂  47-48
  4.3 实验方法  48-50
    4.3.1 原料的水解  48
    4.3.2 水解物清除超氧阴离子（O2-·）能力的测定  48-49
    4.3.3 水解物清除羟基自由基（·OH）能力的测定  49
    4.3.4 水解物清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）能力的测定  49-50
    4.3.5 水解物对Fe~（3+）还原能力的测定  50
    4.3.6 水解物抗脂质过氧化能力的测定  50
  4.4 结果与分析  50-55
    4.4.1 胶原多肽体外清除超氧阴离子（O_2~-·）能力的研究  50-51
    4.4.2 胶原多肽体外清除羟基自由基（·OH）能力的研究  51-52
    4.4.3 胶原多肽体外清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）能力的研究  52-53
    4.4.4 胶原多肽对Fe~（3+）还原能力的研究  53-54
    4.4.5 胶原多肽体外抗脂质过氧化能力的研究  54-55
  4.5 本章小结  55-57
第五章具有清除自由基活性的牛骨胶原多肽表征的研究  57-62
  5.1 引言  57
  5.2 材料与仪器  57-58
    5.2.1 主要仪器  57
    5.2.2 材料与试剂  57-58
  5.3 实验方法  58-59
    5.3.1 牛骨胶原多肽理化指标的测定  58
    5.3.2 产物有效组分的分离  58
    5.3.3 分子量的测定  58
    5.3.4 氨基酸组成的测定  58
    5.3.5 胶原蛋白酶解反应水解度对其产物胶原多肽分子量分布的影响  58-59
  5.4 结果与分析  59-61
    5.4.1 牛骨胶原多肽的主要理化成分  59
    5.4.2 产物有效组分的凝胶色谱分离  59
    5.4.3 最佳清除自由基活性牛骨胶原多肽的分子量测定结果  59-60
    5.4.4 最佳清除自由基活性牛骨胶原多肽氨基酸分析结果  60
    5.4.5 酶解反应水解度与胶原多肽分子量之间的关系  60-61
  5.5 本章小结  61-62
结论与展望  62-65
参考文献  65-71
攻读硕士学位期间取得的研究成果  71-72
致谢  72

牛骨胶原多肽的制备及其清除自由基活性研究

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