学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

利用feeding RNAi技术筛选线虫体内低氧应答剪接相关因子的研究

作　者: 庞剑会
导　师: 刘虎岐
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 可变剪接低氧应答 feeding RNAi 线虫
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 26次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

高等哺乳动物的基因表达调控主要包括转录前、转录中和转录后三个水平, mRNA前体的剪接加工就是转录后水平调控基因表达的一种重要机制。可变剪接是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体的过程。Pre-mRNA剪接的变异和相关因子的突变是造成人类疾病的一大原因。低氧应答是指机体在低于正常氧气浓度下产生的应对低氧损伤的一系列应答机制,以确保机体适应低氧环境并对更严重的缺氧压力产生保护作用。研究证明,秀丽线虫的低氧诱导因子HIF-1的恒定性调控通路和人类的相应通路之间具有高度保守性,低氧也可以引发细胞损伤和死亡,启动一系列细胞应答以减轻缺氧造成的损伤。有报道指出,线虫13%的基因具有可变剪接形式,人类的多数剪接因子在线虫中都能够找到同源基因。另有报道发现细胞低氧应答通路中的转录因子——低氧诱导因子HIF-1α的一种可变剪接可对HIF-1α起负性调控作用。但可变剪接机制作为一种重要的基因表达调控手段,在低氧应答中的作用及可能的调节机制到底如何,目前仍然所知甚少。RNAi是指外源的dsRNA可特异地使机体内与之序列互补的内源基因失活的一种基因沉默机制。Feeding RNAi筛选技术就是利用RNA干涉原理,通过给线虫喂食表达外源的dsRNA的RNAi菌种达到沉默靶标基因的目的。本研究利用物理缺氧小室,在O2浓度为0.2%的条件下,检测到了缺氧在细胞水平和行为学水平对线虫的损伤。并且在前人的基础上不断优化本实验室线虫物理缺氧模型,最终采用浸泡法,成功构建了稳定的线虫物理缺氧耐受性检测体系。通过绘制不同时间点线虫缺氧死亡率曲线,确定了野生型线虫N2低氧条件下的半数死亡期为11h。在此基础上,利用feeding RNAi技术,以线虫体内350个文库中含有的RBP编码蛋白为筛选对象,成功筛选出了6个参与低氧的RBP编码基因;同时,以已知参与低氧的具有可变剪接形式的基因为筛选对象,成功筛选出了4个可能的低氧应答剪接因子,并通过基因序列检测和功能分析初步揭示了这些阳性基因参与低氧应答的可能机制及与已知靶基因的潜在联系,为缺氧损伤的预防治疗及调控机制提供了重要线索,有助于从基因转录表达水平和可变剪接调控水平了解缺血缺氧相关的多种疾病(如心脑血管疾病)的分子机制、临床治疗及新药开发。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章文献综述  9-16
  1.1 引言  9-10
  1.2 真核生物中基因的可变剪接研究进展  10-12
  1.3 秀丽线虫中可变剪接与低氧应答研究现状  12-14
  1.4 可变剪接与RNA 结合蛋白研究现状  14-15
  1.5 研究内容和意义  15-16
第二章秀丽线虫物理缺氧耐受性检测体系的建立  16-23
  2.1 材料  17
    2.1.1 线虫株系及菌株  17
    2.1.2 试剂  17
  2.2 方法  17-19
    2.2.1 线虫的培养  17-18
      2.2.1.1 线虫的冻存与复苏  17
      2.2.1.2 线虫的饲养  17-18
      2.2.1.3 线虫卵的回收  18
    2.2.2 线虫物理缺氧耐受性检测体系的建立  18-19
  2.3 结果  19-20
    2.3.1 线虫缺氧表型分析  19-20
    2.3.3 线虫物理缺氧模型半数死亡期曲线  20
  2.4 讨论  20-22
    2.4.1 线虫饲养及保存  20-21
    2.4.2 线虫低氧耐受性检测体系的建立  21-22
  2.5 小结  22-23
第三章利用 Feeding RNAi 技术筛选线虫体内 RBP 编码基因  23-37
  3.1 材料  25
    3.1.1 线虫及菌种株系  25
    3.1.2 试剂  25
  3.2 方法  25-28
    3.2.1 菌种的培养与保存  25-26
      3.2.1.1 液体细菌培养  25
      3.2.1.2 固体细菌培养  25-26
      3.2.1.3 菌种的保存  26
    3.2.2 利用Feeding RNAi 技术第一次筛选与缺氧相关RBP 编码基因  26-28
      3.2.2.1 线虫feeding RNAi 实验操作  26
      3.2.2.2 线虫物理缺氧检测  26-28
    3.2.3 利用Feeding RNAi 技术第二次筛选RBP 编码基因  28
    3.2.4 阳性基因的测序检测  28
  3.3 结果  28-34
    3.3.1 feeding RNAi 后线虫的行为学变化  28-29
    3.3.2 第一次feeding RNAi 筛选结果  29-33
    3.3.3 第二次feeding RNAi 筛选结果  33
    3.3.4 116 个基因中在线虫中有实验证据支持的有可变剪接形式的16 个基因8 次缺氧筛选结果  33-34
  3.4 讨论  34-36
    3.4.1 线虫feeding RNAi 行为学及干涉效果分析  34
    3.4.2 阳性结果基因功能分析  34-36
  3.5 小结  36-37
第四章结论  37-38
参考文献  38-43
英文缩略词表  43-44
主要仪器设备  44-45
附录  45-53
致谢  53-54
作者简介  54

利用feeding RNAi技术筛选线虫体内低氧应答剪接相关因子的研究

内容摘要

全文目录

相似论文