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放线菌1356抗真菌次级代谢产物分离鉴定及活性研究

作　者: 姜其华
导　师: 何建勇
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 抗真菌鲁斯霉素分离提取核磁共振质谱紫外光谱红外光谱结构确证
分类号: R379
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

放线菌1356菌株是本实验室从土壤放线菌中分离得到的一株具有抗真菌活性的菌株,系griseochromogenes的一个变种。其抗真菌次级代谢产物KZJ-1,在实验室条件下对多种农业致病真菌有很好的抑菌杀菌活性,具有很好的应用前景。本论文利用有机溶媒萃取、大孔吸附树脂洗脱和制备型高效液相等分离提纯方法,成功地从菌株1356发酵液中分离纯化了其抗真菌成分—KZJ-1。同时考察了KZJ-1的理化性质：进行了稳定性试验及纸色谱、pH色谱实验。采用核磁共振波谱(NMR)、质谱(MS)、紫外(UV)、红外(IR)吸收光谱技术确证菌种1356抗真菌代谢产物——KZJ-1为鲁斯霉素；解释该结构在NMT、MS、UV、IR等谱图中的特征吸收峰、共振峰及特征离子的一一对应归属；首次利用二维核磁共振技术确定了鲁斯霉素分子中各个C原子的归属。摸索出KZJ-1液相检测条件为：流速为0.8 mL·min-1,进样量20μL,检测波长303nm,流动相为甲醇：水=75：25,为后续工作奠定了基础。通过胞内外含量测定实验得知,KZJ-1主要存在于菌丝体当中。胞内与胞外活性成分比为7：1,这为发酵液预处理时弃去上清液提供了依据。光热稳定性实验表明,KZJ-1对光热不稳定,特别是光照条件下,KZJ-1极不稳定。KZJ-1甲醇溶液,室温避光条件下放置两个月,活性约降低为原来一半(47.7%)；但自然日光下,一个星期活性降低为原来9.4%,两个星期基本失活。采用制备型高效液相等手段,成功的从菌株1356发酵液中分离提纯出抗真菌活性物质KZJ-1纯度达98.3%。本文利用核磁共振波谱(NMR)、质谱(MS)、紫外(UV)、红外(IR)吸收光谱技术确证KZJ-1为鲁斯霉素,并用二维核磁共振技术重新对共轭烯烃部分C进行归属。

全文目录

摘要  10-11
Abstract  11-12
第一章前言  12-18
  1.1 生物农药  12-13
  1.2 农用抗生素的研究进展  13-14
  1.3 农用抗生素开发的一般模式  14
  1.4 农用抗生素的生物合成一发酵  14-15
  1.5 农用抗生素的分离纯化技术  15-16
    1.5.1 预处理和固液分离  15
    1.5.2 提取(初步分离)  15-16
    1.5.3 精制(高度纯化)  16
    1.5.4 成品制作  16
    1.5.5 其它新型分离技术  16
  1.6 农用抗生素的发展前景  16-17
  1.7 本文的立题背景和主要内容  17-18
第二章材料与方法  18-26
  2.1 菌种、主要试剂、培养基、实验仪器  18-19
    2.1.1 菌种  18
    2.1.2 主要试剂  18
    2.1.3 主要培养基  18-19
    2.1.4 实验仪器  19
  2.2 发酵液的制备及预处理  19-21
    2.2.1 活化菌株  19
    2.2.2 种子制备  19-20
    2.2.3 发酵培养  20
    2.2.4 菌体内外活性物质含量  20
    2.2.5 发酵液预处理  20-21
  2.3 DC2大孔吸附树脂柱洗脱  21
    2.3.1 吸附树脂预处理  21
    2.3.2 装柱  21
    2.3.3 上样  21
    2.3.4 洗脱  21
  2.4 生物活性测定  21-22
    2.4.1 检定菌悬液的制备  21
    2.4.2 生测平板的制备  21-22
    2.4.3 抑菌活性测定  22
  2.5 制备型高效液相纯化  22
    2.5.1 样品制备  22
    2.5.2 制备型高效液相条件选择  22
    2.5.3 纯品制备  22
    2.5.4 分析型高效液相回针检查  22
  2.6 KZJ-1物化性质  22-24
    2.6.1 八种溶剂系统的纸色谱  22-23
    2.6.2 pH纸色谱  23-24
    2.6.3 光热稳定性的考察  24
    2.6.4 酸碱稳定性  24
  2.7 光谱解析  24-26
    2.7.1 紫外光谱  24-25
    2.7.2 红外光谱  25
    2.7.3 质谱  25
    2.7.4 核磁共振  25
    2.7.5 结构确定  25-26
第三章结果与讨论  26-46
  3.1 发酵液的制备及预处理  26-28
    3.1.1 菌体内外活性物质含量  26-28
    3.1.2 粗品的制备  28
  3.2 DC2大孔吸附树脂柱洗脱  28-32
    3.2.1 吸附  28
    3.2.2 洗脱控制  28
    3.2.3 洗脱液颜色  28
    3.2.4 洗脱液活性生物测定  28
    3.2.5 洗脱液液相图谱  28-31
    3.2.6 DC2树脂洗脱结果  31-32
  3.3 制备型高效液相纯化  32-34
    3.3.1 样品制备  32
    3.3.2 制备型高效液相的分离条件  32
    3.3.3 制备液相结果  32-34
  3.4 KZJ-1物化性质  34-37
    3.4.1 KZJ-1纸色谱结果  34-35
    3.4.2 pH纸色谱  35-36
    3.4.3 光热稳定性结果  36-37
    3.4.4 酸碱稳定性  37
  3.5 KZJ-1光谱解析  37-46
    3.5.1 KZJ-1紫外光谱  37-38
    3.5.2 KZJ-1红外光谱  38
    3.5.3 KZJ-1质谱  38-41
    3.5.4 KZJ-1的核磁共振光谱解析  41-46
第四章结论  46-47
参考文献  47-50
致谢  50-51
附录  51-71

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