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4，5-双氢格尔德霉素组分检测及格尔德霉素生物合成后修饰研究

作　者: 张侃
导　师: 何建勇；武临专
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 吸水链霉菌17997 4,5-双氢格尔德霉素 格尔德霉素 液相质谱 点突变 ER结构域
分类号: R915
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


链霉菌以其产生众多有价值的生理活性物质在医药工业中占有重要的地位,尤其是吸水链霉菌次级代谢产物的多样性更值得关注。吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus17997)是从我国土壤中分离得到的一株格尔德霉素(geldanamycin, GDM)产生菌,近年来研究发现GDM具有抗肿瘤和抗病毒等活性,是热休克蛋白90的特异性抑制剂,现成为在抗癌和抗病毒领域中非常有潜力的药物。本论文对S. hygroscopicus17997进行了发酵跟踪,研究了菌株17997的生长及发酵周期,表明其生长始于0-12h,对数生长期是24-60h,稳定期是60-120h；发酵培养的生长期为12-48h,抗生素(格尔德霉素)合成期为48-108h。对来自S. hygroscopicus17997的格尔德霉素制品进行了LC-MS-MS分析,发现其中含有4,5-双氢格尔德霉素组分和其它几种格尔德霉素结构类似物。对S. hygroscopicus17997摇瓶发酵产物的硅胶板薄层层析分析表明,4,5-双氢格尔德霉素组分在发酵中期有积累。已知4,5-双氢格尔德霉素的抗肿瘤活性比格尔德霉素差,因而需要限制其在格尔德霉素制品中的含量。本论文研究结果对以吸水链霉菌17997等为产生菌研究格尔德霉素发酵,促进4,5-双氢格尔德霉素转化为格尔德霉素以提高发酵液的品质,以及检测格尔德霉素制品中的4,5-双氢格尔德霉素组分具有实际意义。格尔德霉素安莎链C4,C5位之间的碳碳键在格尔德霉素生物合成过程中经历了双键→单键→双键这样一个循环,目前推测它对于完成格尔德霉素生物合成PKS后修饰步骤具有重要意义。已知GDM生物合成基因簇的PKS module6中的ER(烯酰还原酶)结构域负责催化C4,C5位碳碳之间的双键→单键步骤,格尔德霉素生物合成后修饰基因gdmP参与了单键→双键步骤。通过破坏格尔德霉素生物合成过程中C4,C5位碳碳之间的单双键循环变化,可以深入了解其在格尔德霉素生物合成中的作用。对烯酰还原酶结构域中NADPH结合位点进行点突变,可以有效地失活该结构域的催化活性,同时不影响PKS后续结构域位点的催化活性。本论文采用PCR扩增技术,在体外对PKS module 6 ER的NADPH结合位点引入突变位点以破坏其NADPH结合功能,进而失活其催化活性,然后通过接合转移、DNA同源双交换技术,将突变失活的ER替换吸水链霉菌17997的野生型ER,筛选获得突变株,对变株的发酵产物进行分析,有可能揭示格尔德霉素生物合成过程中C4,C5位碳碳之间的单双键循环变化在PKS后修饰步骤中的确切作用。目前,本工作还在进行之中,初步获得了发生单交换的变株。

全文目录


摘要  9-11
ABSTRACT  11-12
第一章 前言  12-28
  1.1 格尔德霉素简介  12-13
  1.2 格尔德霉素的抗肿瘤和抗病毒作用  13-15
  1.3 格尔德霉素生物合成途径的研究  15-17
  1.4 格尔德霉素类似物的研究进展  17-19
  1.5 液质联用技术在抗生素组分多样性中的应用  19-21
  1.6 格尔德霉素PKS ER6结构域的研究  21-24
  1.7 定点突变技术简介  24-25
  1.8 安莎类抗生素早期鉴别方法  25-26
  1.9 论文立题依据  26-28
第二章 实验材料  28-33
  2.1 菌种  28
  2.2 质粒  28
  2.3 特殊试剂与酶  28-29
  2.4 实验仪器  29
  2.5 培养基  29-31
  2.6 缓冲液  31-32
  2.7 生物信息学分析工具  32-33
第三章 实验方法  33-38
  3.1 色谱分析方法  33
  3.2 菌种发酵及抗菌活性的测定  33
  3.3 菌浓的测定方法-Packed volume(PCV)  33
  3.4 发酵培养物的提取  33
  3.5 苯安莎类抗生素的碱性显色方法  33
  3.6 PCR反应  33-34
  3.7 TakaRa一般DNA片段的克隆实验(试剂盒)  34
  3.8 大肠杆菌 E.coli DH-5α的培养  34-35
  3.9 E.coli DH-5α感受态细胞的制备  35
  3.10 感受态细胞的转化  35
  3.11 碱变性法提取E.coli质粒  35
  3.12 重组质粒的快速鉴定  35
  3.13 限制酶切反应  35-36
  3.14 线性DNA的去磷酸化  36
  3.15 DNA电泳及片段回收  36
  3.16 DNA连接反应  36
  3.17 大肠杆菌/链霉菌的接合转移实验  36-37
  3.18 链霉菌总DNA提取方法  37
  3.19 微波法提取链霉菌总DNA  37-38
第四章 结果与讨论  38-62
  第一部分 格尔德霉素制品的分析与初步鉴定  38-46
    1.1 格尔德霉素制品的液相分析  38
    1.2 LC-MS-MS鉴别格尔德霉素制品中的4,5-双氢格尔德霉素  38-41
    1.3 格尔德霉素发酵液中4,5-双氢格尔德霉素和氢醌型格尔德霉素发现与鉴别  41-45
      1.3.1 吸水链霉菌17997的生长与合成GDM的研究  41-43
      1.3.2 TLC鉴别格尔德霉素发酵液中4,5-双氢格尔德霉素和氢醌型格尔德霉素  43-45
    1.4 讨论  45-46
  第二部分 格尔德霉素生物合成中4,5位C-C双键形成基因的研究  46-62
    2.1 PKS module 6序列的获得  46-47
    2.2 引物设计及PCR扩增同源臂  47-54
    2.3 接合转移系统的建立  54-56
      2.3.1 质粒pGH112的接合转移  54-55
      2.3.2 重组载体的构建  55-56
    2.4 单交换基因阻断株的获得  56-59
    2.5 讨论  59-62
第五章 结论  62-63
参考文献  63-66
致谢  66-67
附录  67-78
已发表文章  78

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学 > 药物生物学
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