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甜菜夜蛾PBAN受体（PBANR）基因克隆及PBAN与PBANR的相对表达研究

作　者: 程云霞
导　师: 牛长缨；罗礼智
学　校: 华中农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 甜菜夜蛾性信息素 PBAN PBANR G蛋白偶联受体
分类号: S433.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 31次
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内容摘要

为了揭示甜菜夜蛾Spodoptera exigua(H(u|¨)bner)(鳞翅目:夜蛾科)体内性信息素的合成途径及相应的调控基础,为了解其交配行为及改善、提高其性信息素监控技术提供更多的科学依据,本文在认真总结、分析了性信息素合成激活肽受体(PBANR)及性信息素合成激活肽(PBAN)研究进展及存在问题的同时,利用RT-PCR和RACE技术对甜菜夜蛾PBANR基因cDNA全长序列进行了克隆和阐述,对PBAN及PBANR相对表达量进行了检测,得到了一些重要的原创性结果:1、利用RT-PCR结合RACE方法首次从甜菜夜蛾雌成虫性腺组织中克隆到了PBANR基因cDNA全长序列(GenBank accession number:EU365878)。该序列包括了1053bp并编码350个氨基酸残基的甜菜夜蛾PBANR基因开放阅读框。2、应用软件分析氨基酸序列表明甜菜夜蛾的PBANR为G蛋白偶联受体家族成员之一,由7个跨膜结构域,1个胞外N端结构域,1个胞内C端结构域,3个胞外和3个胞内环状结构域组成。与其近缘种海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis(Boisduval)的PBANR氨基酸序列同一性高达98%。3、利用荧光实时定量RT-PCR方法分别检测了PBAN和PBANR在甜菜夜蛾雌成虫脑-咽下神经节复合体、腹神经索、卵巢和性腺的相对表达量,并成功地从量的角度证实了PBAN和PBANR的配体-受体关系。所得的结果为:PBAN和PBANR在这4种组织中均可表达,但其表达量会随组织的不同而异;PBAN相对表达量以脑-咽下神经节的最高(14.71),腹神经索的次之(4.12)、卵巢(1.02)和性腺的最低(1.00),前者的表达量与后三者的差异显著(P＜0.05),后三者之间的差异不显著(P＞0.05);PBANR的相对表达量以性腺的最高(5.36),腹神经索的次之(2.37),脑-咽下神经节(1.00)和卵巢(0.74)的最低。前者的相对表达量显著高于后三者的(P＜0.05),但后三者的相对表达量差异不显著(P＞0.05)。4、利用荧光定量实时RT-PCR方法测定了3日龄雌成虫PBAN和PBANR在昼夜24h中6个时间点的相对表达量,PBAN在光期(07:00-21:00)的表达量均较低,进入暗期后PBAN的表达量明显增加,到23:30(进入暗期2.5h)达到最大值之后明显下降(进入暗期6.5h)。PBANR的相对表达量与PBAN的同步性较为一致。即进入光期的4.5h到进入暗期的6.5h之间,PBAN和PBANR相对表达量的变化趋势几乎相同。虽然PBAN和PBANR不同时间点的表达量没有显著差异(P＞0.05),但这些结果与甜菜夜蛾性信息素释放及交配的昼夜节律相一致。5、利用荧光实时定量RT-PCR方法测定1-5日龄雌成虫脑-咽下神经节复合体PBAN和性腺PBANR的相对表达量所获的结果为:PBAN的相对表达量随雌成虫日龄的增加而升高,到5日龄时达到最大。其中5日龄PBAN的相对表达量显著高于1、2日龄的(P＜0.05),但与3、4日龄的差异不显著(P＞0.05)。另外,1-4日龄成虫的PBAN表达量差异也不显著(P＞0.05)。PBANR的相对表达量也随日龄的增加而升高。其中第4d的表达量与第5d、2d的差异不显著(P＞0.05),但与第1d、3d的差异显著(P＜0.05)。另外,1-3 d的表达量差异也不显著(P＞0.05)。回归分析结果表明,1-5d内PBAN和PBANR的相对表达量均随与成虫日龄的增加而呈显著的直线上升趋势(P＜0.05):PBAN的回归方程为Y=0.2175+0.5999X,R=0.7790;PBANR的回归方程:Y=0.8479+0.2655X,R=0.6470)。这与1-5日龄甜菜夜蛾具有旺盛的交配能力相吻合。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-11
1 立题依据  11-20
  1.1 前言  11-12
  1.2 PBAN、PBANR及性信息素合成的调控  12-20
    1.2.1 PBAN的研究进展  12-13
    1.2.2 PBANR的研究  13-16
    1.2.3 性信息素合成的调控  16-18
    1.2.4 研究目的和意义  18-20
2 材料与方法  20-55
  2.1 方案设计  20-23
    2.1.1 PBANR cDNA全长序列的克隆  21-22
    2.1.2 荧光实时定量RT-PCR技术  22-23
  2.2 PBANR cDNA序列全长的克隆  23-40
    2.2.1 虫源及饲养方法  23-25
    2.2.2 试剂  25
    2.2.3 PBANR基因特异片段的克隆  25-31
    2.2.4 PBANR基因的3′RACE  31-33
    2.2.5 PBANR基因5′RACE  33-39
    2.2.6 开放阅读框(Open reading frame,ORF)的校正  39-40
  2.3 PBAN和PBANR的相对表达量的确定  40-55
    2.3.1 实验材料  40
    2.3.2 主要试剂  40-41
    2.3.3 引物设计及筛选  41-42
    2.3.4 总RNA提取  42
    2.3.5 DNase Ⅰ处理去除基因组DNA污染  42-43
    2.3.6 反转录  43-44
    2.3.7 定量片段的确认  44
    2.3.8 标准曲线的获得  44-45
    2.3.9 批内和批间变异  45-46
    2.3.10 不同组织中PBAN与PBANR的相对表达量  46-49
    2.3.11 昼夜不同时间PBAN与PBANR的相对表达量  49-51
    2.3.12 不同日龄雌成虫PBAN与PBANR的相对表达量  51-53
    2.3.13 数据分析和统计  53-55
3 结果  55-90
  3.1 甜菜夜蛾PBANR的克隆  55-66
    3.1.1 甜菜夜蛾PBANR基因cDNA片段的克隆  55-56
    3.1.2 甜菜夜蛾PBANR基因3′RACE的克隆  56-57
    3.1.3 甜菜夜蛾PBANR基因5′RACE的克隆  57-58
    3.1.4 甜菜夜蛾PBANR基因的开放阅读框的校正  58-60
    3.1.5 PBANR基因cDNA全序列及结构分析  60-66
  3.2 PBAN和PBANR的实时荧光定量PCR  66-90
    3.2.1 特异引物筛选  66-68
    3.2.2 基因组DNA的去除  68-71
    3.2.3 定量基因参照片段的确认  71-72
    3.2.4 标准曲线  72-79
    3.2.5 批内和批间变异  79-83
    3.2.6 雌成虫不同组织中PBAN和PBANR的相对表达量  83-85
    3.2.7 昼夜不同时间点雌成虫PBAN和PBANR的相对表达量  85-87
    3.2.8 不同日龄雌成虫PBAN和PBANR的相对表达量  87-90
4 讨论与结论  90-97
  4.1 甜菜夜蛾PBANR基因mRNA全长序列的克隆  90-91
  4.2 雌成虫PBAN和PBANR的相对表达量  91-95
  4.3 结论与问题  95-97
参考文献  97-109
致谢  109

甜菜夜蛾PBAN受体（PBANR）基因克隆及PBAN与PBANR的相对表达研究

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