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菌株PNR2次生代谢产物结构与抗菌活性研究

作　者: 常虹
导　师: 郭坚华；叶永浩
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 土曲霉固体发酵次生代谢产物 X射线单晶衍射抑菌活性
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 25次
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内容摘要

生物源农药就是利用有益的微生物或微生物的代谢产物制作加工而成,是有益农业微生物应用领域中的重要研究对象。土曲霉(Aspergillus terreus)是一种普遍存在于自然环境中的真菌,本文选择了一株具有较好抑菌活性的土曲霉为研究对象,菌株编号为PNR2。将其进行固体发酵,对其发酵产物进行分离纯化,以期找到具有高效抑菌活性的化合物。菌株PNR2分离自江苏省徐州地区的番茄根围土壤,该菌对油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、玉米小斑病菌、棉花枯萎病菌、小麦根腐病菌有良好的拮抗效果；尤其对油菜菌核病菌和番茄灰霉病菌抑制效果明显,抑菌半径分别达到15 mm、8 mm。为了研究菌株的生物特性及开发价值,我们对菌株进行了ITS序列同源性分析,形态学及部分生理特点鉴定,确定将其归属为Aspergillus terreus, NCBI中GenBank登录号为FJ842764。菌株采用以小麦麸皮作为基质的固体发酵,发酵物用1v：1v的氯仿和甲醇混合液充分萃取,减压蒸干得到粗提物；再将其经甲醇-水系统(85v：15v)除蜡,甲醇-丙酮系统(85v：15v)除盐后得到305 g浸膏。浸膏的初步分离采用硅胶柱(1500g,200～300目),以甲醇：氯仿的混合溶液为洗脱液,按0：100→1：100→2：100→4：100→8：100→16：100→100：0进行梯度洗脱,得到7个组分,各组分再经柱层析、薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、重结晶等方法进行进一步分离纯化。化合物的构型测定结合了质谱(ESI-MS)、二维核磁共振(2D-NMR)等多种光谱技术,分析确定了其中2种化合物。化合物1是由组分1经过一次硅胶柱层析得到的组分,经丙酮重结晶得到。结合化合物1的1H-NMR、HMBC、13C-NIVIR及DEPT-135图谱可以推断该化合物的分子式为C13H14O6,不饱和度为7。再利用该化合物的HMQC谱可以将其平面结构确定为6,8-dihydroxy-3,4,5-trimethyl-1- oxoisochroman-7-carboxylic acid。通过x射线单晶衍射分析判断该化合物的手性构型为S型,其绝对构型可以确定为(3R,4S)-6,8-dihydroxy-3,4,5-trimethyl-1- oxoisochroman-7-carboxylic acid,即dihydrocitrinone。化合物2是由组分2经过四次硅胶柱层析所得到的组分,将化合物2的1H-NMR图谱与本实验室人员分到的细胞松弛素N的1H-NMR图谱进行比较,发现两者的特征峰一致,又经过TLC检测,将其确定为细胞松弛素N(cytochalasin N)。测定了化合物1对19株植物病原菌的活性,包括10株植物病原真菌和9株植物病原细菌。结果表明：化合物1对所测植物病原细菌无抑制作用,对油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌有很好的抑制活性,IC50分别为：0.23、0.56、72.2μg/ml。其中,化合物1的单晶结构和抑菌活性为首次报道,化合物2也是首次在土曲霉中发现,并且化合物1对油菜菌核病菌和番茄灰霉病菌有非常显著地抑制作用,具有很大的研发潜力,为生物源农药的进一步开发与研制奠定基础。

菌株PNR2次生代谢产物结构与抗菌活性研究

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