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海洋枯草芽胞杆菌DM03抗病原真菌物质的研究

作　者: 田化平
导　师: 何进；张吉斌
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 海洋枯草芽胞杆菌 植物病原真菌 抑菌活性 抗菌蛋白 分离
分类号: S476.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


本研究从200株深海细菌中筛选出14株对植物病原真菌具有稳定拮抗作用的深海细菌,从中筛选出抑菌活性较强的菌株DM03,对其分类学地位进行鉴定,确定其拮抗谱,并对该菌所产生的抑菌活性物质进行了初步的分离、纯化以及鉴定。结果如下：1.以水稻纹枯病、棉花枯萎病和油菜菌核病三类植物病原真菌为指示菌株,对国家海洋局第三海洋研究所提供的200株深海细菌进行了初步筛选,获得14株具有明显的广谱抑制植物病原真菌的深海细菌,经过复筛获得一株抑菌活性较强,所产抑菌物质的理化性质较为稳定的枯草芽胞杆菌DM03,发现其发酵液对实验室现有的植物病原真菌都有良好的抑菌效果,在PDB培养基中培养48 h后得到无菌上清滤液也表现出良好的抑真菌生长活性。2.菌株DM03的发酵液与病原真菌对峙实验表明,DM03对植物病原真菌的抑制机理表现为营养竞争抑制与抑菌活性产物抑制相结合。3.对菌株DM03所产的抑菌活性物质的理化性质进行研究表明,其抑菌活性物质对温度不敏感,在100℃处理10 min依然能观察到抑菌活性,在pH 3～11和紫外照射处理后其抑菌活性依然存在,说明该物质具有良好的稳定性。该活性物质经硫酸铵盐析沉淀,沉淀复溶于Tris-HCl缓冲液后,使用100 KDa超滤管进行超滤,该物质被截留,说明其分子量大于100 KDa。截留液经native-PAGE分离可得到两条具有抑真菌活性的蛋白条带,切出蛋白条带,经胶内胰蛋白酶酶解后,进行基质辅助激光解离飞行时间质谱分析,发现其中一种蛋白与现已见报道的枯草芽胞杆菌产生的蛋白质谱图均不相同,表明DM03所产的抑菌活性物质可能含有一种新的蛋白类抑菌物质。4.实验结果表明,菌株DM03在适宜其生长的海水培养基中不产活性物质,只有在PDB培养基中才能收集到活性物质产物,这表明其活性物质的产生可能与其生长环境的变化有关。其具体原因还在进一步的研究中。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
第一章 文献综述  9-22
  1.1 植物病害及生物防治概况  9-10
    1.1.1 植物病害概述  9
    1.1.2 植物病害生物防治概况  9-10
  1.2 农用抗生素研究概况  10-12
    1.2.1 农用抗生素的研究现状  11-12
  1.3 海洋微生物源农用抗生素的研究概况  12-13
    1.3.1 海洋微生物是农用抗生素的重要来源  12
    1.3.2 海洋微生物产生的抑菌活性物质  12-13
  1.4 枯草芽胞杆菌在植物病害生物防治中的应用概况  13-20
    1.4.1 枯草芽胞杆菌抗植物病原真菌的研究进展  13-16
    1.4.2 枯草芽胞杆菌抗植物病原真菌的机制  16-17
    1.4.3 枯草芽胞杆菌产生的抑菌物质  17-20
  1.5 研究目的及意义  20-22
第二章 材料与方法  22-32
  2.1 实验材料  22-24
    2.1.1 菌株  22-23
    2.1.2 实验仪器  23
    2.1.3 培养基  23-24
  2.2 实验方法  24-32
    2.2.1 深海细菌的活化  24
    2.2.2 产活性物质菌种筛选  24-25
    2.2.3 菌株DM03的形态学鉴定  25
    2.2.4 菌株DM03的生理生化鉴定  25
    2.2.5 菌株DM03的16S rDNA序列分析  25-27
    2.2.6 菌株DM03抑菌谱测定  27-28
    2.2.7 海洋细菌DM03所产活性物质的稳定性研究  28
    2.2.8 菌株DM03抑菌物质的分离  28-32
第三章 结果与分析  32-44
  3.1 活性菌株的筛选  32-33
  3.2 细菌DM03的形态学特征  33-34
  3.3 细菌DM03的生理生化结果  34-35
  3.3 16S RDNA序列分析  35-37
    3.3.1 16S rDNA基因扩增产物  35
    3.3.2 16S rDNA基因测序结果  35-36
    3.3.3 菌株DM03的系统发育树  36-37
  3.4 菌株DM03发酵液上清的抑菌谱  37-39
  3.5 菌株DM03所产的抑菌物质稳定性  39-40
  3.6 活性物质的分离  40-42
    3.6.1 有机溶剂萃取  40
    3.6.2 硫酸铵沉淀  40-41
    3.6.3 分子量大小的初步确定  41
    3.6.4 Native-PAGE  41-42
  3.7 MALTI-TOF/MS指纹图谱  42-44
第四章 结论  44-45
第五章 讨论  45-47
参考文献  47-52
致谢  52

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 捕食性昆虫的利用
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