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重要植物病原细菌的高通量分子检测技术研究及应用

作　者: 田艳丽
导　师: 胡白石
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: padlock探针高通量分子检测植物病原细菌
分类号: S432.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

在植物的发病早期快速、准确鉴定出病原菌,以防止其传播和流行、减少经济损失具有重要的意义。发展快速、灵敏、高通量的分子检测技术对提升我国植物病害控制水平,尤其是阻止外来农林危险生物入侵、保护我国农林经济安全生产与生态安全有着重要意义。目前基于PCR技术的分子检测方法无法满足对大批量样本检测的需要,因此寻找其他的分子检测靶标,发展植物病原菌高通量检测方法,对完善病原细菌分子检测技术、提升我国植物检疫的技术水平和提升我国植物病害控制水平具有重要意义。高通量是目前植物病原菌分子检测的发展方向,而基于PCR扩增的普通分子检测方法无法一次检测多种病原菌。因此,发展高通量检测方法对于农业生产和口岸检疫具有重要意义。分子探针和DNA阵列技术等技术的出现为发展植物病原菌高通量检测提供了新的思路和方法。Padlock探针是一种长的寡核苷酸探针,其两端的序列可通过与靶标DNA序列互补配对而使探针结合成环状。Padlock探针不仅具有非常高的特异性,同时还可与DNA阵列技术结合进行高通量检测。本研究设计了6种重要植物病原菌(Erwinia amylovora,Erwinia pyrifoliae, Pantoea stewartii subsp. stewartii, Acidovorax avenae subsp.citrulli, Xanthomonas oryzae py.oryzae, Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的padlock探针,并对这些探针的特异性和灵敏度进行了验证。试验结果表明,所设计探针只能从对应的病原菌DNA中扩增出100bp大小的片段,而在非目的病原菌的DNA中不能扩增出片段。不同探针的灵敏度分别为10pg和1pg。将这些探针与Macroarray相结合,通过一次扩增能够同时检测6种病原菌,建立了这些植物病原菌的高通量分子检测技术,并将该技术应用于实际样品的检测。本文建立的高通量分子检测技术可望应用于口岸和田间对这些植物病原菌的检测。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
引言  10-11
上篇文献综述  11-38
  第一章植物病原菌检测技术的研究进展  12-38
    1 常用的分子生物学检测技术  13-23
      1.1 PCR及其相关技术  13-20
        1.1.1 扩增病原菌的致病性基因  14
        1.1.2 rRNA-PCR  14-15
        1.1.3 ITS-PCR  15
        1.1.4 tDNA-PCR  15-16
        1.1.5 Nest-PCR  16
        1.1.6 Multiplex-PCR  16
        1.1.7 Real-time Quantitative PCR  16-19
        1.1.8 rep-PCR  19
        1.1.9 AFLP  19
        1.1.10 Immuno-PCR  19-20
        1.1.11 IMS-PCR  20
      1.2 DNA阵列技术  20-21
      1.3 Padlock探针  21-23
    2 植物病原菌分子检测的具体特点  23-29
      2.1 检测技术特点  24-28
      2.2 经济要求  28-29
    3 目前植物病原菌分子检测的局限  29-30
    4 未来植物病原菌分子检测展望  30-32
    参考文献  32-38
下篇研究内容  38-70
  第一章重要植物病原菌的高通量分子检测技术研究  40-70
    1 材料和方法  42-49
      1.1 供试菌株  42
      1.2 培养基及溶液的配置  42-43
      1.3 基因组DNA的提取  43-46
      1.4 Padlock探针的设计  46
      1.5 探针的连接与外切酶处理  46
      1.6 探针的扩增  46-47
      1.7 Macroarray高通量检测  47
      1.8 探针的特异性和灵敏度验证  47
      1.9 对实际样品检测  47-49
        1.9.1 对市场哈密瓜种子的检测  47-48
        1.9.2 对宁夏甜瓜样品检测  48
        1.9.3 对安徽自然发病越冬的水稻样品的检测  48-49
        1.9.4 对水稻种子样品的检测  49
        1.9.5 人工接种发病的梨叶片的检测  49
    2 结果与分析  49-60
      2.1 探针设计结果  49-50
      2.2 探针的特异性验证  50-51
      2.3 探针的灵敏度验证  51-53
      2.4 探针的高通量检测  53-55
      2.5 对实际样品的检测结果  55-60
        2.5.1 对市场哈密瓜种子的检测结果  55-56
        2.5.2 对宁夏甜瓜样品检测结果  56-57
        2.5.3 对安徽自然发病越冬的水稻样品的检测结果  57-58
        2.5.4 对水稻种子样品的检测结果  58-59
        2.5.5 人工接种发病的梨叶片的检测结果  59-60
    3 讨论  60-62
    参考文献  62-70
附录利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌  70-80
  1.材料与方法  71-74
    1.1 参试菌株  71-73
    1.2 菌悬液的制备  73
    1.3 引物设计与合成  73
    1.4 PCR体系及反应条件  73
    1.5 模拟种子带菌菌体PCR检测  73
    1.6 对市售哈密瓜种子的检测  73-74
  2 结果  74-76
  3.讨论  76-78
  参考文献  78-80
攻读硕士学位期间发表的研究论文及申请的专利  80-82
致谢  82

重要植物病原细菌的高通量分子检测技术研究及应用

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