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牛精液冷冻稀释液新配方研究

作　者: 蔡虹
导　师: 杨利国
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 牛精液冷冻保存冷冻保护剂抗冷休克物质稀释液
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本研究所用精液采自西门塔尔、夏洛莱、利木赞和安格斯各3头种公牛,通过改变牛精液冷冻保存液组成成分,检测了不同种公牛冷冻前后精子活力、顶体完整率及精子畸形率,从而了解不同个体和品种对精液冷冻效果的影响,并筛选出牛精液冷冻稀释液新配方,以提高牛精液冷冻保存的效果,提高人工授精受胎率。试验及主要结果如下:1、为了分析用大豆卵磷脂替代卵黄的精液冷冻保存效果,并筛选大豆卵磷脂最适浓度,分二个试验。①在牛冷冻精液稀释液国家标准推荐的配方基础上,添加1%、3%、5%、7%、9%的大豆卵磷脂替代卵黄。结果发现:当卵磷脂浓度为3%时,精液解冻后精子活率(为42.11±3.62%)显著高于对照组(冻后活力为38.334±2.45%,p＜0.05)。卵磷脂浓度为5%时,解冻后活力为41.004±3.77%,仍高于对照组(p＞0.05)。冻后各组精子顶体完整率和畸形率差异较小(p＞0.05)。②以Tris-柠檬酸缓冲液为稀释液,添加1%、3%、5%、7%、9%的大豆卵磷脂替代卵黄,结果发现:当卵磷脂浓度为3%时,精液解冻后精子活力(39.56±3.40%)高于对照组(35.89±2.32%,p＞0.05),而各组精子顶体完整率和畸形率没有显著差异(p＞0.05)。因此,牛冷冻稀释液中添加3%和5%的卵磷脂冷冻效果较好。2、为了比较甘油(G)、乙二醇(EG)和二甲基酰胺(DA)三种抗冻保护剂两两配合的冷冻保护效果,分别设置了1%、3%、5%三个浓度两两正交组合,结果发现:5%G+3%EG、5%G+3%DA、3%EG+3%DA几个试验组效果较好,冻后活力分别为40.334±2.52%、38.674±1.15%、39.004±1.00%,均高于各自的对照组(p＞0.05)。其中5%G+3%EG解冻后活力最高,精子顶体完整率也较高,畸形精子较少。3、为了比较甘油(G)、乙二醇(EG)和二甲基酰胺(DA)三种抗冻保护剂联合应用的冷冻保护效果,分别设置了1%、3%、5%三个浓度进行正交组合,结果发现:1%G+3%EG+3%DA组合冷冻效果最好(冻后活力达40.004±2.65%),高于对照组(p＞0.05)。但解冻后顶体完整率在各试验组间,试验组和对照组间差异均不显著(p＞0.05)。4、为了分析牛个体和品种对精子冷冻解冻的影响,分别取西门塔尔(XM)、利木赞(LM)和夏洛莱牛(XL)的精液进行冷冻,并检测了精子冷冻前后活力、冷冻后顶体完整率和精子畸形率。结果:XM、LM和XL鲜精活力无明显差异(p＞0.05)。但是冷冻解冻后,XL精液冻后活力显著低于XM和LM(p＜0.05),顶体完整率和畸形率差异不显著(p＞0.05)。

全文目录

摘要  9-11
Abstract  11-13
第一部分牛精液冷冻保存技术研究进展  13-35
  1 引言  13
  2 国内外牛冷冻精液生产现状与发展趋势  13-15
    2.1 国内外牛冷冻精液生产现状  13-14
      2.1.1 冷冻方法  13
      2.1.2 冷冻-解冻后精子活力  13-14
      2.1.3 冷冻精液人工授精的受胎率  14
    2.2 国内外牛冷冻精液发展趋势  14-15
  3 精液稀释液成分研究进展  15-23
    3.1 营养物质  16-17
    3.2 缓冲物质  17-18
    3.3 维持渗透压物质  18
    3.4 防冷休克保护剂  18-20
    3.5 抗冻保护剂  20-21
    3.6 抗氧化物质  21-22
    3.7 抗菌物质  22
    3.8 其他添加物质  22-23
  4 精液冷冻保存方法的研究进展  23-25
    4.1 精液冷冻保存的冷源  23-24
    4.2 冷冻程序  24
    4.3 分装  24-25
  5 冷冻过程中精子细胞的损伤变化  25-27
    5.1 精液的成分变化  25
    5.2 不同冷冻速度对精子的损伤  25-26
    5.3 细胞膜损伤造成的精子损伤  26
    5.4 精子形态的变化  26
    5.5 精子细胞内成分的变化  26-27
  6 影响精子冻后存活的因素  27-29
    6.1 种属差异  27
    6.2 冷冻精子的基因  27-28
    6.3 冷冻前精子的质量  28
    6.4 渗透性冷冻保护剂  28
    6.5 精液稀释液  28
    6.6 细胞内的Ca~(2+)  28-29
    6.7 活性氧ROS  29
  7 牛精液冷冻保存效果评定方法研究进展  29-35
    7.1 评定指标和方法  29-33
      7.1.1 外观检查法  29-30
      7.1.2 精子活动能力评定  30
      7.1.3 精子密度评定  30-31
      7.1.4 精子畸形率和顶体完整率评定  31-32
      7.1.5 精子存活时间和生存指数  32
      7.1.6 精子细胞膜完整性的评价  32
      7.1.7 精液中酶的活性  32-33
      7.1.8 受精能力的检测  33
    7.2 精液品质评定的新方法和新设备  33-35
      7.2.1 精液品质分析仪  33
      7.2.2 流式细胞计数仪分析精子染色体结构  33-34
      7.2.3 流式细胞计数仪分析精子质膜变化  34
      7.2.4 荧光极化各向异性测定精子质膜流动性  34-35
第二部分试验研究  35-60
  1 目的和意义  35-36
  2 材料和方法  36-42
    2.1 试验材料  36-38
      2.1.1 试验动物  36
      2.1.2 主要仪器和设备  36
      2.1.3 主要药品及试剂  36-37
      2.1.4 溶液配制  37-38
    2.2 试验方法  38-40
      2.2.1 精液采集  38
      2.2.2 鲜精品质的评定  38
      2.2.3 精液的稀释  38-39
      2.2.4 平衡与分装  39
      2.2.5 精液冷冻  39
      2.2.6 冷冻精液的解冻  39
      2.2.7 精液品质检查指标及方法  39-40
      2.2.8 统计分析  40
    2.3 试验设计  40-42
      2.3.1 测定不同个体和品种牛的精液品质  40-41
      2.3.2 采用大豆卵磷脂替代卵黄  41
      2.3.3 甘油、乙二醇和二甲基酰胺混合试验  41-42
  3 结果与分析  42-52
    3.1 外观检查结果  42
    3.2 pH检查  42-43
    3.3 不同个体和品种牛的鲜精及解冻后精液品质的差异  43-44
    3.4 卵磷脂替代卵黄  44-47
      3.4.1 国标稀释液基础上卵磷脂替代卵黄  44-47
      3.4.2 Tris-柠檬酸稀释液基础上卵磷脂替代卵黄  47
    3.5 三种抗冻保护剂的不同组合替代纯甘油  47-52
      3.5.1 甘油(G)和乙二醇(EG)组合  47-48
      3.5.2 甘油(G)和二甲基酰胺(DA)组合  48-49
      3.5.3 乙二醇(EG)和二甲基酰胺(DA)组合  49-50
      3.5.4 G、EG、DA组合  50-52
  4 讨论  52-58
    4.1 精液的颜色和pH  52
    4.2 大豆卵磷脂替代卵黄的效果  52-53
    4.3 甘油、乙二醇和二甲基酰胺混合替代纯甘油冷冻的效果  53-54
      4.3.1 甘油、乙二醇和二甲基酰胺两两组合的冷冻效果  53-54
      4.3.2 甘油、乙二醇和二甲基酰胺三者组合的冷冻效果  54
    4.4 牛的品种及个体差异和精液品质的关系  54-55
    4.5 精液冷冻保存的几个技术问题  55-56
      4.5.1 稀释液pH  55
      4.5.2 稀释方法、温度  55
      4.5.3 精液冷冻的平衡时间  55-56
    4.6 稀释基础液中各种物质的选择  56-57
      4.6.1 缓冲液的选择  56
      4.6.2 糖类的选择  56-57
      4.6.3 蒸馏水的使用  57
    4.7 稀释液优化组合  57-58
  5 小结  58-60
    5.1 本研究获得的结果  58-59
    5.2 本研究的创新点  59
    5.3 本研究的不足之处  59
    5.4 下一步值得研究的工作  59-60
参考文献  60-71
致谢  71

牛精液冷冻稀释液新配方研究

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