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探索FHL2在斑马鱼中的同源基因对其发育的影响

作　者: 张宇声
导　师: 王继德；姜泊
学　校: 南方医科大学
专　业: 内科学
关键词: 斑马鱼 FHL2 Morpholino 血管生成胚胎发育
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

目的/背景FHL2(four and half LIM domain protein)是仅有LIM结构域的蛋白质,属于LIM蛋白家族成员。它由四个半LIM结构域组成,每个LIM结构域包括两个锌指结构,这种结构提示LIM家族成员可能较为广泛的参与调节蛋白质之间的相互作用并影响细胞的各种生物学行为。在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大肠癌都发现FHL2的高表达。体外研究发现FHL2在多株胃肠癌细胞株中高表达,抑制FHL2可诱导癌细胞的分化。此外,近来有研究发现,FHL2在脉管组织的发生过程中可能起一定作用,在包括主动脉弓部(aortic arch arteries)、背侧大动脉(dorsal aorta)以及节间动脉(intersegmental arteries,IA)的胚胎发生发育过程中均检测到其表达,在心脏的各个房室间隔(compartments)中亦得到表达。小鼠中与人类FHL2同源基因的表达与其伤口愈合的快慢呈显著正相关关系,其表达集中于伤口肉芽组织的纤维样细胞中。这些结果提示,FHL2在肿瘤发生、发展中的作用可能有赖于其对血管生成的影响。近来有研究显示,FHL2的表达跟某些恶性肿瘤的发生、发展关系密切,其机制可能涉及了对血管生成(Angiogenesis)的干预。因此,对其进行进一步深入研究具有明确的科学意义和潜在的临床意义。斑马鱼是脊椎动物,也是一种研究广泛的模式生物,其基因组以及发育过程与人类具有比较高的同源性和相似性。此外,对于斑马鱼胚胎期的基因表达干预,已经建立了一些比较成熟可靠的实验方法,可以有效改变某个特定基因的表达水平,譬如利用Morpholino策略干扰胚胎发育早期的基因表达。Fli-1是一个转基因的斑马鱼品系,通过它可以在活体实现对斑马鱼胚胎发育过程中的血管系统进行不间断的观察:flil启动子可以在斑马鱼的的整个胚胎发生的过程中介导EGFP(The Enhanced Green Fluorescent Proteins,增强型绿色荧光蛋白)在所有血管组织的表达。人类FHL2在斑马鱼中确实具有同源性较高的基因,且这个基因在胚胎发育的初期既有一定程度的转录。这一现象提示,该基因可能在斑马鱼的胚胎发育早期就起到一定作用。因此,我们应用斑马鱼这一生物模型从一个特定的角度来探索人类FHL2基因的功能。方法1.利用TIGR Gene Idices和NCBI的BLAST在线比对软件,搜寻人类FHL2在斑马鱼中的同源基因,并对两者的相似性进行分析。2.委托美国Gene Tools公司设计并合成两段针对该斑马鱼基因的morpholino oligonucleotides;理论上,其中之一的作用在于抑制基因的表达、翻译,另一个则能够干扰转录本的正常剪切并可能最终得到长度异常的靶基因转录本,指导翻译出长度及序列异常的蛋白质。3.通过显微注射将morpholino导入斑马鱼的受精卵:4.通过RT-PCR检测人类FHL2在斑马鱼中的同源基因zgc:92428在morpholino作用下其mRNA水平的改变:通过RT-PCR检测zgc:92428基因在斑马鱼不同的胚胎发育期的表达。5.通过显微注射将morpholino导入斑马鱼的受精卵后观察其生长发育情况,并通过荧光显微镜观察斑马鱼胚胎循环系统的发育情况。同时,把48hpf作为时间点,计数了其中产生明显肉眼可见缺陷的胚胎以及存活的胚胎,并计算缺陷率和存活率,采用配对设计的t检验以比较5个实验循环中对照组与实验组的差别,并且当P≤0.05时认为差异具有统计学意义。结果:1)人类FHL2基因与斑马鱼中代号为Danio rerio zgc:92428的基因具有高度同源性。2)人类FHL2在斑马鱼中的同源基因zgc:92428在斑马鱼胚胎发育早期有表达。3)用反义morpholino寡聚核苷酸在斑马鱼胚胎中抑制了与人类FHL2同源的基因zgc:92428的mRNA水平。4)斑马鱼中的受精卵中已经携有来自母体的zgc:92428基因的mRNA转录本。5)FHL2-MOATG和FHL2-MOE3I3可导致斑马鱼胚胎的发育阻滞及异常,这些异常都伴有斑马鱼胚胎脉管系统的发育阻滞,其中FHL2-MOATG还能增加胚胎的死亡率。结论1.成功利用在线数据库确定了人类FHL2基因与斑马鱼中代号为Danio reriozgc:92428的基因具有高度同源性。2.反义morpholino寡聚核苷酸在斑马鱼胚胎中可降低与人类FHL2同源的基因zgc:92428的mRNA水平,可能可抑制其转录。3.利用RT-PCR证实人类FHL2在斑马鱼中的同源基因zgc:92428在斑马鱼胚胎发育早期即有表达,并有一部分mRNA转录本来自于母体。4.人类FHL2在斑马鱼中的同源基因zgc:92428在斑马鱼胚胎发育早期可能起到关键作用,其机制可能涉及对血管生成的干预。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-11
前言  11-16
材料  16-19
实验方法  19-25
结果  25-43
讨论  43-49
全文小结  49-50
参考文献  50-52
中英文缩写对照  52-54
在读期间成果  54-55
致谢  55-56

探索FHL2在斑马鱼中的同源基因对其发育的影响

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