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猪胰腺弹性蛋白酶原在毕赤酵母中的表达及纯化

作　者: 张雅军
导　师: 雷新根
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物与人的比较营养
关键词: 猪胰腺弹性蛋白酶原基因克隆毕赤酵母基因表达蛋白纯化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 96次
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内容摘要

弹性蛋白酶（Elastase,ELA）作为丝氨酸蛋白酶,是一种水解不溶性弹性蛋白为特征的广谱蛋白水解酶。由于其广谱的蛋白水解活性,不仅在医疗上有较高的应用价值,而且在食品、日用化工及污水处理等方面也发挥着重要的作用。到目前为止,商业、医药途径获得的弹性蛋白酶主要从猪胰胰腺中提取,受胰腺资源的限制,弹性蛋白酶价格昂贵;同时也不可避免地混杂其它蛋白酶,如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。微生物生产的弹性蛋白酶具有产率高、生产工艺简单、生产成本较低等优点,颇有发展前途。本研究的目的就是试图通过基因工程的方法利用微生物生产一种高效价廉的重组弹性蛋白酶原产品。根据NCBI GenBank猪胰腺弹性蛋白酶原Ⅱ（proELA2）基因设计一对特异引物,以RT-PCR法从猪胰腺细胞中克隆并得到了含有proELA2基因完整开放阅读框（open reading frame,ORF）的cDNA,将proELA2 cDNA与pTA2克隆载体连接,经测序分析表明与NCBI GenBank中猪胰腺弹性蛋白酶Ⅱ基因序列完全一致。然后将proELA2基因连接到表达质粒pPICZαA得到重组质粒pPICZαA-proELA2,经PmeⅠ酶线性化切开后,通过电穿孔将线性重组质粒整合到毕赤酵母（Pichiapastoris）KM71染色体上,利用含不同浓度抗生素（Zeocin）的YPDS平板对转化子进行抗性筛选。采用实时定量实时PCR对mRNA表达量高的转化子进行筛选,mRNA表达量高的转化子进行BMGY摇瓶培养后于BMMY用甲醇进行诱导,在醇氧化酶1（AOX1）强启动子的作用下,实现了猪胰腺弹性蛋白酶原在毕赤酵母中的表达,表达产物在α-因子信号肽的引导下成功地分泌到胞外。用Ni Sepharose High Performance亲和层析柱纯化C端-附有6×His的重组蛋白,目的蛋白经SDS-PAGE检测后确定约为32kDa的重组表达产物,与预期目的蛋白产物大小基本相符。纯化蛋白后经Westerenblot分析确定为proELA2目的蛋白,进一步说明重组proELA2在毕赤酵母中获得了成功表达。通过对proELA2在摇瓶培养表达条件的初步探索,得到优化条件:BMGY（pH6.0）培养转化子至OD₆₀₀值约为3.0时,使用同体积的BMMY（pH6.0）培养基重悬细胞,于29℃,250r/min,每隔24h补加0.75%（v/v）的甲醇,诱导132h,重组酵母KM71/pPICZαA-proELA2表达较好。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
前言  11-14
第一章文献综述  14-28
  1 弹性蛋白酶的来源、特性及其研究进展  14-20
    1.1 动物性来源的弹性蛋白酶特性及其研究进展  14-16
    1.2 微生物源的弹性蛋白酶特性及其研究进展  16-20
  2 弹性蛋白酶的作用机理  20-22
    2.1 弹性蛋白的结构、性质  20
    2.2 弹性蛋白酶对弹性蛋白作用机理的研究进展  20-22
  3 弹性蛋白酶的功能与用途  22-25
    3.1 弹性蛋白酶在医药方面的应用  22-23
      3.1.1 改善脂质代谢、保护肝脏和抑制动脉硬化  22
      3.1.2 降血压、耐缺氧保护心肌  22-23
      3.1.3 其它作用  23
    3.2 弹性蛋白酶在食品工业方面的应用  23-24
    3.3 弹性蛋白酶在日用化工方面的应用  24
    3.4 生物防治的辅助剂  24
    3.5 环境保护  24-25
  4 弹性蛋白酶的应用前景和面临的问题  25-26
  5 巴斯德毕赤酵母表达系统的应用  26-28
    5.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的优越性  26
    5.2 毕赤酵母启动外源基因的表达机制及菌株与表型  26-28
第二章材料与方法  28-64
  1 材料和仪器  28-32
    1.1 材料  28
    1.2 试剂  28-29
    1.3 主要培养基  29
    1.4 主要溶液  29-30
    1.5 主要仪器设备  30-31
    1.6 引物设计与合成  31-32
  2 实验方法  32-45
    2.1 proELA2基因的克隆  32-35
      2.1.1 胰腺组织总RNA的提取  32
      2.1.2 基因的扩增  32-34
      2.1.3 TA克隆和测序  34-35
    2.2 P.pastoris/pPICZαA-proELA2表达载体的构建  35-38
      2.2.1 含EcoR Ⅰ和XbaI限制性酶切位点目的基因片段扩增  35-36
      2.2.2 PCR产物和pPICZαA质粒的酶切与连接  36-37
      2.2.3 感受态细胞的转化与阳性克隆的筛选  37-38
    2.3 重组猪proELA2酶原的酵母转化与表达  38-42
      2.3.1 重组表达载体pPICZαA-proELA2的线性化  38
      2.3.2 pPICZαA-proELA2重组质粒毕赤酵母的转化与转化子的筛选  38-41
      2.3.3 重组猪proELA2酶原的诱导表达  41
      2.3.4 重组蛋白的纯化和Western blot验证  41-42
    2.4 摇瓶诱导表达条件的探索  42-45
      2.4.1 诱导时间对目的蛋白表达水平的影响  43
      2.4.2 抗性水平对目的蛋白表达水平的影响  43
      2.4.3 甲醇添加方式对目的蛋白表达水平的影响  43-44
      2.4.4 生长菌密度对目的蛋白表达水平的影响  44
      2.4.5 诱导培养液起始pH值对目的蛋白表达水平的影响  44-45
  3 实验结果与分析  45-56
    3.1 猪胰proELA2编码基因TA克隆  45-47
      3.1.1 总RNA的提取与proELA2编码区RT-PCR扩增  45
      3.1.2 proELA2基因TA克隆  45-46
      3.1.3 pTA2-proELA2酶切鉴定及测序  46-47
    3.2 pPICZαA-ELA2重组表达质粒的构建及鉴定  47-49
      3.2.1 含酶切位点proELA2基因片段的扩增结果  47
      3.2.2 pPICZαA质粒的双酶切  47-48
      3.2.3 阳性克隆PCR检测与酶切鉴定  48-49
    3.3 P.pastoris/pPICZαA-proELA2表达菌株的转化与筛选  49-51
      3.3.1 重组质粒的线性化  49-50
      3.3.2 PCR检测转化子  50
      3.3.3 Real-Time RT-PCR对转化子RNA表达量的检测  50-51
    3.4 proELA2在P.pastoris中的表达、纯化与Western blot验证  51-52
    3.5 摇瓶诱导表达条件的探索  52-56
      3.5.1 诱导时间对目的蛋白表达水平的影响  53
      3.5.2 抗性水平对目的蛋白表达水平的影响  53-54
      3.5.3 甲醇添加方式对目的蛋白表达水平的影响  54
      3.5.4 初始菌密度对目的蛋白表达水平的影响  54-55
      3.5.5 pH值对目的蛋白表达水平的影响  55-56
  4 讨论  56-62
    4.1 胰腺组织总RNA的提取  56
    4.2 巴斯德毕赤酵母菌的转化  56-57
    4.3 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达  57-58
    4.4 毕赤酵母转化子的摇瓶诱导条件  58-60
      4.4.1 重组蛋白的降解问题  58-59
      4.4.2 诱导菌的起始密度和诱导时间  59
      4.4.3 甲醇的添加方式  59
      4.4.4 摇瓶内培养通气量、pH值、营养成份  59-60
      4.4.5 Zeocin抗性水平  60
    4.5 目的蛋白的纯化  60-62
  5 结论与展望  62-64
    5.1 proELA2的激活与活性检测及其使用安全性评估  62
    5.2 优化proELA2工程菌的发酵工艺研究  62
    5.3 proELA2的稳定性与提高活性研究  62-63
    5.4 改造proELA2的分子结构提高其活性  63
    5.5 改变表达系统进行proELA2的表达  63-64
参考文献  64-69
附录  69-71
致谢  71

猪胰腺弹性蛋白酶原在毕赤酵母中的表达及纯化

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