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关节软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞向软骨样细胞分化的研究

作　者: 刘晓强
导　师: 陈宗雄
学　校: 福建医科大学
专　业: 外科学
关键词: 骨髓间充质干细胞 BMSCs 关节软骨细胞 Transwell共培养 Ⅱ型胶原免疫组化
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:(1)分离、培养及鉴定骨髓源性间充质干细胞( Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs),并获取高纯度的BMSCs;(2)分离、培养及鉴定关节软骨细胞(Articular Cartilage Cells,ACs),并获取高纯度的ACs;(3)BMSCs与ACs共同培养诱导,并检测其诱导结果;(4)对共培养生物诱导与TGF-β1化学诱导的结果进行比较。方法:(1)获取并培养、增殖高纯度骨髓间充质干细胞:从SD大鼠(4周龄)的股骨及胫骨干中取得骨髓,联合利用密度梯度离心法及差异贴壁法分离、纯化BMSCs,体外扩增并传代后,相差显微镜下观察细胞的形态及流式细胞仪检测细胞表面标记:CD29、CD90、CD34及CD45,再通过成脂肪样、成骨样及成神经样细胞多向分化诱导,检测其诱导结果,确定所得细胞为BMSCs,为下一步实验打下基础。(2)获取并培养、增殖高纯度的关节软骨细胞:从SD大鼠(4周龄)的正常股骨头表面取得关节软骨片,先后运用0.25%的胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶消化软骨片,当相差显微镜下见有大量软骨细胞游离后,离心、弃上清液,加入含15%FBS的软骨细胞培养液进行培养、扩增传代,并取样行台盼蓝染色计数。当细胞传至第三代时,运用甲苯胺蓝染色及HE染色检查、鉴别该细胞,确定所得细胞为关节软骨细胞,为下一步实验打下基础。(3)BMSCs与ACs在Transwell共培养:分别吸取第三代BMSCs和ACs,按1:1的细胞比例分别植于Transwell共培养系统中,下室植入BMSCs,上室植入ACs,同时设置相同浓度单独BMSCs空白对照组,分别在用含10%FBS的高糖DMEM培养基培养,相差显微镜下观察细胞的增殖和基质合成情况,并对各组细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组化染色检查。(4)共培养生物诱导与TGF-β1化学诱导的比较:将BMSCs用于TGF-β1(10 ng/m1)诱导,同时与1:2,1:1,2:1(关节软骨细胞:BMSCs)浓度的细胞共培养诱导组比较对照。并运用MTT比色法检查、氨基聚糖(GAG)含量检测及WESTERN BLOT检测各组细胞Ⅱ型胶原基因表达量,确定其诱导情况。结果:(1)获取并培养、增殖高纯度BMSCs:相差显微镜下观察结果:原代细胞接种12h后可见部分细胞贴壁,24h后细胞大量贴壁,外观呈现纺锤形或多角形。72h后细胞数量开始增多,大部分细胞形态呈长梭形、似成纤维细胞。培养10d左右细胞铺满培养瓶底达80%左右,细胞呈极性排列,部分集落可呈漩涡状。细胞表面标记物经流式细胞仪检测结果:BMSCs均一地表达CD29及CD90,阳性率分别为92.5%及94.4%;而CD34和CD45为阴性,阴性率分别为99.3%和99.7%。成脂肪样、成骨样及成神经样细胞诱导均获得成功。(2)获取并培养高纯度的ACs:运用上述方法可获得一定纯度的ACs。在倒置相差显微镜下观察发现:软骨细胞接种12h后开始贴壁,48h完成贴壁。原代培养的ACs呈圆形及多角形,胞浆丰富,胞核圆形,居中,细胞长成一片可呈明显的铺路石样外观,与长梭形的成纤维细胞较易区分。试验证明:经本方法消化培养后仅见单一的软骨细胞生长。(3)BMSCs与ACs共培养:共培养组BMSCs数量增多,细胞外基质合成丰富,其基质能被Ⅱ型胶原免疫组化染色,细胞染色呈现黄色。(4)共培养生物诱导与TGF-β1化学诱导的比较:共培养细胞生物诱导的MTT比色法检查、氨基聚糖(GAG)含量检测及Ⅱ型胶原WESTERN BLOT检测结果显示:各组细胞共培养诱导结果均不差于TGF-β1 10ng/m的l化学诱导结果,但1:1、2:1共培养组诱导统计结果差异不明显。结论:(1)密度梯度离心和差异贴壁法可以获取纯度较高的BMSCs;(2)高纯度的ACs可以经胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶联合消化后,过滤、离心、培养获得;(3)BMSCs与ACs共培养可作为修复关节软骨的种子细胞。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
前言  8-10
  1. 关节软骨细胞特性的研究  8-9
  2. BMSCs 与关节软骨细胞相互作用的研究  9
  3. 本课题内容分为四个部分  9-10
第一部分获取并培养、增殖高纯度的骨髓间充质干细胞  10-21
  实验目的  10
  材料与方法  10-14
  结果  14-18
  讨论  18-20
  小结  20-21
第二部分获取并培养、增殖高纯度的关节软骨细胞  21-30
  实验目的  21
  材料与方法  21-25
  结果  25-27
  讨论  27-29
  小结  29-30
第三部分 BMSCs 与关节软骨细胞 Transwell 共培养  30-36
  实验目的  30
  材料与方法  30-32
  结果  32-34
  讨论  34-35
  小结  35-36
第四部分共培养生物诱导与 TGF-β1 化学诱导的比较  36-45
  实验目的  36
  材料与方法  36-37
  结果  37-42
  讨论  42-44
  小结  44-45
全文结论  45-46
参考文献  46-52
缩略词表  52-53
综述  53-61

关节软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞向软骨样细胞分化的研究

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