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HSP70-2基因多态性对北京油鸡精液品质的影响及其抗热应激功能验证

作　者: 刘伟平
导　师: 陈国宏；陈继兰
学　校: 扬州大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 北京油鸡 繁殖性能 热应激 HSP70-2基因
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本研究以北京油鸡种公鸡为试验材料,以热休克蛋白70-2基因(HSP70-2)为候选基因,分析该基因5’侧翼区和编码区的遗传多态性与北京油鸡公鸡精液品质的相关性,并研究热应激对不同基因型公鸡繁殖性状及HSP70-2基因mRNA表达量的影响。旨在为北京油鸡繁殖力标记辅助育种研究奠定基础。试验一:选用220只北京油鸡成年公鸡为研究对象,检测HSP70-2的多态性,并分析其多态性及基因型(组合)对精液品质性状的影响。试验二:在试验一基础上,按基因型组合选用84只30周龄北京油鸡公鸡,分成热应激组(37℃,10h;30℃,14h)和对照组(23℃;24h),应激10天,测定精液品质、受精率、入孵蛋孵化率、受精蛋孵化率、健雏率及HSP70-2基因mRNA表达量。研究不同基因型及其组合公鸡抗热应激能力的差异。主要研究结果如下:1.采用PCR-SSCP、PCR-RFLP及测序技术对HSP70-2基因进行多态性筛查,结果发现A-68G(P5)、G286C(P7)和A1054G(P8)三个突变。用TFSEARCH软件预测发现,P5位点的突变产生了一个MZF-1调控元件的结合位点,可能对HSP70-2基因的转录产生影响;编码区P7和P8位点发生的突变为沉默突变,未引起氨基酸序列的改变。多态位点基因型与精液品质关联分析表明,5’侧翼区P5位点AG基因型为精子活力、精子活率、精子畸形率的不利基因型,编码区P7位点GG基因型为精子活力和精子畸形率的优势基因型,P8位点AG基因型为精液pH和精子畸形率的不利基因型。2.P5、P7和P8三位点两两组合基因型与精液品质性状关联分析的结果表明,P5P7位点AGCC基因型组合和P5P8位点AGAG基因型组合为精子活力及畸形率的不利基因型。3.选择P5、P8两个位点共五种组合基因型个体进行热应激试验,结果表明,应激后五种基因型组合个体精子活力均出现不同程度下降,畸形率较对照组显著升高(P<0.05)。AGAG型的精液品质受热应激影响下降最严重。五种基因型组合HSP70-2基因mRNA表达检测结果表明,不同处理组相同基因型间表达差异显著(p<0.05),热应激后AAAA型最高,AGGG型最低。不同基因型相同处理组间表达差异显著(p<0.05),AAAA型在应激组中最高,AGAG基因型表达量受热应激影响最大。4.孵化试验结果表明,P5P8热应激期间,P5、P8两个位点组合中突变纯合基因型GGGG型受精率、孵化率和健雏率高于杂合基因型AGAG型。两种基因型热应激期的受精率、孵化率和健雏率显著低于恢复期,应激结束一至两周后恢复正常。AGAG基因型受精率、孵化率和健雏率受温度影响较大。综上所述,HSP70-2基因的突变可能是影响北京油鸡精液品质的重要因素之一,剔除P5P8组合中AGAG不利基因型个体,可能提高北京油鸡的繁殖性能。同时,本试验首次从鸡繁殖性能角度验证了HSP70-2基因抗热应激功能的存在。

全文目录


中文摘要  8-10
Abstract  10-14
第一章 文献综述  14-25
  1. 公畜繁殖性状的研究意义  14-15
  2. HSP70-2 基因研究进展  15-17
    2.1 HSP70-2 与精子发生  15-17
      2.1.1 HSP70-2 与生精细胞的细胞周期  15-16
      2.1.2 HSP70-2 与生精细胞联会复合体(SC)的装配  16
      2.1.3 HSP70-2 在生精细胞凋亡中的作用  16-17
    2.2 HSP70-2 基因结构及定位  17
    2.3 HSP70-2 作为鸡繁殖性状分子标记的可行性  17
  3. 热应激与繁殖性状  17-20
    3.1 热应激  17-18
    3.2 热应激对种公畜繁殖机能的影响  18-20
      3.2.1 热应激对射精量的影响  18-19
      3.2.2 热应激对精子活力的影响  19
      3.2.3 热应激对畸形率的影响  19
      3.2.4 热应激对精子密度的影响  19-20
  4. 遗传标记辅助选择  20-22
    4.1 遗传标记  20
    4.2 单核苷酸多态性  20-21
    4.3 SNPs 的检测方法  21-22
      4.3.1 PCR-SSCP 法  21
      4.3.2 PCR-RFLP  21-22
      4.3.3 高分辨率熔解曲线  22
  5. 实时荧光定量 PCR 分析技术  22-25
    5.1 实时荧光定量PCR 的原理  23
    5.2 实时荧光定量PCR 的定量方法  23-25
      5.2.1 标准曲线法的相对定量  24
      5.2.2 标准曲线法的绝对定量  24
      5.2.3 比较Ct 法的相对定量  24-25
第二章 北京油鸡 HSP70-2 基因多态性与鸡精液品质性状的相关性研究  25-44
  1. 材料  25-26
    1.1 试验动物与饲养  25
    1.2 样品的采集  25
    1.3 主要试剂  25-26
      1.3.1 精液品质检测  25
      1.3.2 基因组DNA 提取  25-26
      1.3.3 PCR-SSCP  26
      1.3.4 酶切  26
  2. 试验方法  26-31
    2.1 精液品质测定  26-28
      2.1.1 精液量  26-27
      2.1.2 精液pH  27
      2.1.3 精子活率  27
      2.1.4 精子活力  27
      2.1.5 精子畸形率  27
      2.1.6 精子密度  27-28
    2.2 鸡基因组DNA 提取  28
    2.3 引物设计及扩增  28-30
      2.3.1 引物设计  28-29
      2.3.2 目的片段的扩增  29-30
    2.4 测序  30
    2.5 PCR-SSCP  30-31
      2.5.1 非变性聚丙烯酞胺凝胶的制备  30
      2.5.2 硝酸银染色  30-31
    2.6 酶切  31
    2.7 数据统计和分析  31
  3. 结果  31-36
    3.1 北京油鸡基因组DNA 和PCR 产物结果  31-32
      3.1.1 基因组DNA 提取结果  31-32
      3.1.2 PCR 产物结果  32
    3.2 北京油鸡HSP70-2 基因多态性分析结果  32-35
      3.2.1 HSP70-2 基因P1、P2、P3 位点测序分析图  33-34
      3.2.2 P5 位点多态性分析  34
      3.2.3 P7 位点多态性分析  34
      3.2.4 P8 位点多态性分析  34-35
    3.3 HSP70-2 基因多态性与精液品质相关性状最小二乘分析  35-36
      3.3.1 HSP70-2 基因单位点不同基因型与精液品质性状关联分析  35
      3.3.2 HSP70-2 基因两位点组合基因型与精液品质性状关联分析  35-36
  4. 讨论  36-42
    4.1 基因组DNA 的提取及检测  36-39
    4.2 关于影响PCR 扩增反应的因素  39
    4.3 PCR-SSCP 法的优化  39-40
    4.4 PCR-RFLP 法  40
    4.5 HSP70-2 基因单核苷酸多态分析  40-42
      4.5.1 单位点单核苷酸多态性与精液品质性状分析  40-41
      4.5.2 双位点组合基因型与精液品质性状分析  41-42
  5. 结论  42-44
第三章 热应激对 HSP70-2 基因不同组合基因型公鸡繁殖性能的影响  44-64
  1. 试验材料  44-45
    1.1 试验动物与饲养  44
    1.2 样品的采集  44-45
    1.3 主要试剂  45
  2. 试验方法  45-50
    2.1 精液品质测定  45-46
    2.2 受精率、孵化率及健雏率  46
    2.3 实时荧光定量PCR 引物设计  46
    2.4 总 RNA 提取及 cDNA 第一链合成、检测  46-48
      2.4.1 总RNA 提取  46-47
      2.4.2 总RNA 检测  47
      2.4.3 cDNA 第一链合成  47
      2.4.4 cDNA 第一链合成检测  47-48
    2.5 荧光定量PCR  48
      2.5.1 荧光定量PCR 反应体系  48
      2.5.2 荧光定量PCR 扩增程序  48
    2.6 统计分析  48-50
      2.6.1 荧光定量计算方法  48-49
      2.6.2 引物扩增效率计算  49-50
      2.6.3 数据整理与统计  50
  3. 结果  50-60
    3.1 短期热应激对北京油鸡种公鸡精液品质的影响  50-54
      3.1.1 热应激对HSP70-2 基因单位点不同基因型精液品质性状关联分析  50-53
      3.1.2 热应激对HSP70-2 基因两位点不同基因型组合精液品质性状关联分析  53-54
    3.2 热应激对不同基因型组合受精率、孵化率及健雏率的影响  54-56
    3.3 RNA 及反转录检测  56-60
      3.3.1 常规PCR 及测序结果  57
      3.3.2 Real-time 荧光定量检测  57-59
      3.3.3 候选基因mRNA 表达结果  59-60
  4. 讨论  60-63
    4.1 短期热应激对北京油鸡HSP70-2 基因不同基因型精液品质影响  60-61
    4.2 短期热应激对北京油鸡HSP70-2 基因不同基因型种蛋受精率、孵化率和健雏率的影响  61
    4.3 HSP70-2 基因不同基因型表达分析  61-63
  5. 结论  63-64
第四章 全文结论  64-65
参考文献  65-73
致谢  73-75
攻读学位期间发表学术论文目录  75

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家禽 > 鸡
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