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小胶质细胞在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓及运动皮层中的变化

作　者: 尹云霞
导　师: 郭艳苏；李春岩
学　校: 河北医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 肌萎缩侧索硬化腰髓运动皮层小胶质细胞 CD11b Iba1 SOD1 转基因小鼠
分类号: R744
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种致死性神经系统变性疾病,表现为进行性肌肉萎缩、肌无力和锥体束征。患者多在首次出现症状后的3-5年内因球麻痹、呼吸衰竭或肺部感染而死亡。病理上以选择性上或/和下运动神经元丢失为特征,伴有小胶质细胞及星形胶质细胞活化。约5-10%为家族性ALS(familial ALS,fALS),90-95%是散发性ALS(sporadic ALS, sALS)。fALS和sALS的临床表现很相似,大约20% fALS病例及4% sALS病例与铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase 1,SOD1)有关,其中以G93A位点突变最常见,即在基因密码子第93位点甘氨酸代替丙氨酸。SOD1-G93A转基因小鼠表现为进行性运动神经元变性,与人类ALS相似,是世界上研究ALS的公认动物模型。用人SOD1(human SOD, hSOD1)转基因鼠进行体内和体外研究,发现人突变SOD1(human mutant SOD1, hmSOD1)通过以下途径使运动神经元受损,包括:异常蛋白质聚集、线粒体功能失调、氧化应激、细胞骨架异常、轴浆运输受损、谷氨酸兴奋毒性、生长因子缺乏及神经炎症等。神经炎症是指一种细胞和分子过程,包括小胶质细胞和星形胶质细胞的活化及周围免疫细胞的浸润,在中枢神经系统(central nervous system, CNS)的多种病理条件下会发生,包括神经变性疾病如ALS等。神经炎症是ALS病人及hmSOD1模型小鼠的病理学特征,而神经胶质增生是神经变性疾病中神经炎症的共同特点。在ALS神经炎症部位,主要有星形胶质细胞、小胶质细胞及少量的T-淋巴细胞。大量证据表明,炎症在ALS中起关键作用,然而小胶质细胞-神经元相互作用导致运动神经元病的本质仍然不明。目前广泛研究的是小胶质细胞慢性、有害的神经炎症引起神经元变性。本实验用世界上广泛研究的ALS动物模型SOD1-G93A小鼠作为研究对象,应用免疫组织化学及激光共聚焦方法研究转基因小鼠疾病不同时期运动皮层及腰髓小胶质细胞形态及数量变化,应用免疫印迹法研究小胶质细胞特异性标记物随病程的表达变化,探讨小胶质细胞在SOD1-G93A转基因小鼠疾病进程中的变化规律,分析其运动神经元死亡中的可能作用,为ALS治疗提供潜在靶点。方法:1转基因鼠的繁殖所有转基因鼠均饲养在恒温(25-27℃)、恒湿、无特定病原菌(specific pathogen free,SPF)环境中,以灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料、无菌水进行喂养,每个鼠笼随机饲养3-5只小鼠。动物实验过程遵守河北省实验动物管理办法规定。为维持B6SJL-TgN(SOD1-G93A)1 Gur转基因小鼠突变基因稳定下传,将B6SJL SOD1-G93A/+半合子雄鼠与B6SJLF1/J雌鼠交配繁殖,两种小鼠均购自美国Jackson实验室(Bar Harbor, ME, USA),最初由Gurney等研制。子代鼠尾部组织在三周左右经PCR基因扩增鉴定,确定是否带有hSOD1基因。2运动功能评分及实验分组2.1运动功能评分运动功能评分从小鼠50天开始每天评分一次。采用4分评分系统。(1)4分正常,无运动障碍; (2)3分悬尾时后肢震颤; (3)2分步态异常; (4)1分至少一侧后肢拖拽; (5)0分将小鼠仰或侧卧,30秒内不能翻正。2.2实验分组依据SOD1-G93A小鼠的发病规律分为症状前期(60天)、症状早期(100-120天)和终末期(130-150天)3个时间点取材。每个时间点设有模型组、同窝对照组。模型组为SOD1-G93A转基因小鼠,对照组为非转基因同窝对照小鼠,每组每个时间点6只小鼠,均为雌性。症状前期组取自出生后60天,体重无减轻且无临床症状,评分4分。症状期指体重开始减轻、出现步态异常,评分2分。终末期以SOD1-G93A小鼠体重减轻>20%,仰卧30秒不能翻身为准,评分0分。3实验方法3.1取材实验期间每天观察动物、评分及称重。在SOD1-G93A小鼠症状前期(60天)、症状早期(100-120天)和终末期(130-150天)时取材,同窝对照小鼠在相应时间点取材。用10%的水合氯醛(350mg/Kg)腹膜内注射麻醉后,分别以4%多聚甲醛灌流固定保存或新鲜取腰髓或运动皮层组织迅速投入液氮速冻后于-80℃冰箱保存。3.2免疫印迹(Western blotting)分别取10mg腰髓及运动皮层组织按试剂盒说明提取总蛋白,BCA法测蛋白浓度。每个样品按30μg蛋白上样,10%SDS-PAGE电泳后转膜至PVDF膜,室温脱脂奶粉(PBS稀释)封闭1小时后,分别加兔抗CD11b抗体(1:200)、鼠抗GAPDH抗体(1:200)及羊抗SOD1抗体(1:200),4℃摇床过夜。次日,TPBS洗膜5次,每次5分钟。然后分别加入抗兔、抗小鼠和抗羊荧光二抗(1:3000)室温孵育1小时,TPBS洗膜4次,PBS洗膜1次,每次均为5分钟,Odyssey红外扫描成像系统(美国LI-COR公司)扫膜并分析结果。计算目的条带与GAPDH的灰度比值并进行统计学处理。3.3免疫组织化学法脊髓及运动皮层组织经4%多聚甲醛固定后,Leica VT 1000S振动切片机切成20μm切片,0.01M PBS溶液漂洗5分钟×3次;3%H2O2浸泡15分钟以封闭组织内源性过氧化物酶;0.01M PBS漂洗5分钟×3次后,0.3% tritonX-100穿孔15分钟。10%马血清室温封闭1小时后,加入兔抗Iba1抗体(1: 200) 4°C过夜;0.01M PBS洗5分钟×3次后,加生物素化二抗(山羊抗兔IgG)室温2小时;0.01M PBS洗5分钟×3次;加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温1小时;0.01M PBS洗5分钟×3次,DAB染色10分钟,捞片,脱水,透明及封片。3.4共聚焦显微镜法腰髓组织经4%多聚甲醛固定后,继而用30%蔗糖/4%多聚甲醛溶液浸泡12小时至组织沉底,以保护组织免受冰冻损伤。冷冻包埋剂OCT包埋后,经Leica CM1850冷冻并切成30μm切片,与免疫组化方法相似,经漂洗、穿孔、封闭及抗Iba1抗体孵育后,FITC标记羊抗兔二抗室温孵育1小时,PBS漂洗后,抗荧光衰减封片剂封片,Olympus FV1000观察及摄影。3.5小胶质细胞计数采用Nikon 50i科研级显微镜。每个时期3只小鼠,每只小鼠随机取5个视野,400×放大倍数下分别计数SOD1-G93A转基因小鼠症状前期、症状早期及终末期腰髓前角及运动皮层有完整胞体的Iba1阳性小胶质细胞数目,并与非转基因对照小鼠相比较。3.6统计学分析实验结果以均数±标准差表示,采用SPSS 13.0.4软件,统计方法为多样本参数方差分析。P<0.05有统计学意义。结果:1转基因鼠的鉴定子代鼠基因组DNA的PCR产物电泳显示:位于300-400bp之间的条带(324bp),为内参照IL-2的PCR产物;位于200-300bp之间的条带(236bp),为人SOD1基因的PCR产物。2临床表现在60天及以前,SOD1-G93A小鼠无明显临床变化,评分4分。80-90天左右,悬尾实验时小鼠开始出现双后肢震颤,评分3分。在100-120天左右SOD1-G93A小鼠逐渐出现一侧或双侧后肢明显无力、肌肉萎缩及步态异常,评分2分。之后,双后肢进行性肌肉萎缩,不能支撑身体,进而至少一侧后肢完全瘫痪,行走时拖拽,评分1分。约在130-150天左右,将其仰卧后30秒内小鼠不能自行翻转,体重下降超过20%,达到终末期,评分0分。而同窝对照组小鼠无上述表现,评分始终为4分。3小胶质细胞变化3.1通过免疫印记法观察小胶质细胞特异性标记物CD11b表达量,发现同窝对照组小鼠腰髓表达量很少,且在60天至150天之间,随年龄增长其表达无明显差异(P>0.05)。在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓,症状前期表达即有所增多,症状早期明显升高,终末期达高峰(P<0.05)。而在SOD1-G93A转基因小鼠运动皮层,CD11b表达与同窝对照组相比无显著差别(P>0.05)。3.2通过小胶质细胞特异性标记物Iba1免疫组化染色,发现同窝对照组腰髓前角Iba1阳性小胶质细胞数目较少,胞体小且突起少,且在150天龄之前,随年龄变化其数量无明显差异。在SOD1-G93A转基因小鼠症状前期,Iba1阳性小胶质细胞数目轻度增多,症状早期明显增多,胞体增大,突起增粗,终末期更著。而在症状早期及终末期的脊髓后角,Iba1阳性小胶质细胞数目也存在轻度增生,但程度远不及前角。在运动皮层,SOD1-G93A转基因小鼠与同窝对照组相比Iba1阳性细胞数目无明显差别。结论:SOD1-G93A转基因小鼠疾病进展过程中存在小胶质细胞增生,且早在症状前期已经发生,症状早期增生显著,终末期达高峰。小胶质细胞增生的部位与疾病受损部位一致,且增生程度与病变严重程度成正比。SOD1-G93A转基因小鼠腰髓小胶质细胞的活化可能参与运动神经元的损伤过程。

全文目录

中文摘要  4-9
英文摘要  9-16
前言  16
材料与方法  16-24
结果  24-26
附图  26-31
附表  31-32
讨论  32-35
结论  35-36
参考文献  36-40
综述神经变性病与神经炎症  40-48
  参考文献  44-48
致谢  48-49
个人简历  49

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