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DSs/rh-BMP-2/CS复合微球的制备及成骨活性研究

作　者: 夏远军
导　师: 尹庆水
学　校: 南方医科大学
专　业: 外科学
关键词: 壳聚糖硫酸葡聚糖重组人骨形态发生蛋白微球组织工程
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

骨缺损是长期困扰骨科临床有效治疗的难题,骨肿瘤、严重的骨创伤均可能引起骨缺损,因此各种骨修复材料相继推出,主要包括自体骨、异体骨和人工骨等类型。自体骨吸收快,效果好,但是受来源问题的限制；异体骨、异种骨则因免疫排斥反应在临床应用受到限制,而且其存在传染疾病的风险。人工骨凭借具备取材广泛、易加工、生物相容性好、价格低廉、能消毒、利于临床操作等优点,成为目前人工骨修复材料的主流。人工骨修复材料主要包括无机材料和有机材料两类,前者以羟基磷灰石(hydroxylapatite,HA)和磷酸三钙(tricalcium phosphate,TCP)为代表,后者则以聚乳酸、聚乙醇酸或两者的共聚物为代表。无机材料相对于有机材料,机械强度好,其中珊瑚羟基磷灰石(Coralline Hydroxyapatite, CHA)更是因来源广泛、生物相容性好、骨传导作用好、对人体无害等特点而受到临床应用的青睐。尽管人工骨已经应用于临床并取得了较好的效果,但是植入体内的人工骨往往不能满足临床需要,导致植骨失败。这是因为人工骨(直径>5mm)植入人体后,人工骨中心部位营养物质供应不足,氧分压低,不能满足人工骨中心部位的种子细胞生长、增殖、分化和成骨的需要,导致种子细胞停止生长甚至死亡,使成骨效应丧失,其根本原因在于组织工程骨骨诱导效应不强；另外,人工骨的成骨效应欠佳也是制约人工骨发展的一个重要原因。为此,国内外研究了三种方法解决人工骨的骨化活性：一种是采用联合细胞培养,将培养的细胞与人工骨复合,将不同类型的细胞进行混合培养,通过细胞间存在着精细的相互调控关系来促进细胞的生长分化。常用来培养的细胞有成纤维细胞,平滑肌细胞和成骨细胞。联合细胞培养的优点是活细胞能促进成骨效应,但操作繁琐,培养周期长,临床不易于推广；另外一种方法就是采用显微外科手术来促进人工骨的骨诱导效应,目前主要有预购带血管蒂筋膜瓣包裹人工骨、带血管蒂肌瓣包裹人工骨。预购复合组织瓣具有血供可靠,人工骨存活能力强,抗感染能力强等优点,但缺点也很明显,就是先需行预购手术,增加了病人的痛苦；还有一种方法就是采用细胞生长因子来促进人工骨骨诱导效应,方法简便,临床易于推广。相对来说,采用细胞生长因子促进人工骨骨化活性具有显著地临床应用优势,已经成为该领域研究的热点,近期关于细胞生长因子促进人工骨骨诱导效应的文章发表在国际相关研究领域的顶尖杂志上。目前用于促进人工骨骨化生长因子有骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMPs),血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),转化生长因子-β(transforming growth factor-P,TGF-p)等。而对于骨诱导效应的研究,主要集中在BMPs上,目前研究表明BMPs具有明显的成骨效应。但是因半衰期短,容易代谢流失,不能维持足够的浓度。目前,通过缓释载体负载活性生长因子可有效地解决这一问题。近年来,对负载活性生长因子缓释载体的研究正受到越来越广泛的重视和关注,从传统载体到各种载药微球载体,目标是延长生长因子的缓释时间,精确控制释放浓度,拓展其适用范围。但是,对于怎样利用缓释微球来调控活性细胞因子按照临床要求进行释放,以最大限度的促进人工骨成骨诱导活性,是需要解决的主要问题。近年来微球控释技术的发展和人工可降解材料及其复合材料的不断涌现,为活性细胞因子的可控缓释和组织工程化人工骨成骨诱导活性的提高提供了前所未有的机遇和条件。将微球控释系统应用于活性生长因子的缓释,为外源性生长因子的开发与利用开辟了新的研究空间。针对人工骨成骨诱导活性缓释微球的研究,国内外很多学者利用高分子合成与结构控制技术制备了骨形态发生蛋白缓释微球,取得良好的成骨效应,但是在微球结构控制、微球分子和生长因子之间的相互作用对生长因子释放过程的影响以及如何通过微球结构实现对生长因子释放过程的调控尚需要深入研究。特别是为了提高载生长因子复合微球促进成骨诱导活性,必须深入研究负载生长因子的聚合物微球促进骨化活性的影响因素,这些包括：微球种类、微球结构、生长因子种类以及微球和生长因子之间的相互作用机制、生长因子的释放过程控制等。因此本项目构建了一种重组人骨形态发生蛋白的聚合物复合微球,取得了良好的骨诱导效应。由于性能优异的聚合物微球载体,是让细胞生长因子按照临床需要控释的关键。本项目选用壳聚糖(CS)为合成载体微球的模型聚合物,壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖,其分子2位上有游离氨基,通过醛氨缩合反应使之形成键桥固化微球,可将药物固定在其骨架中,其微球具有无毒、生物相容性好、生物可降解、控制药物释放、增加药物局部滞留、提高药物的生物利用度等特点。但是重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖复合微球载药率较低(33.437±2.290μg/mg),究其原因,主要是重组人骨形态发生蛋白与壳聚糖之间的作用主要是静电作用,在微球的制备过程中,无法大量的结合。因此我们引入硫酸葡聚糖(DS)作为中间载体,硫酸葡聚糖与骨形态发生蛋白有肝素结合位点,能广泛结合,制备的硫酸葡聚糖／重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖微球具有更好的载药率和稳定释放效应。目前,有关负载活性生长因子缓释载体的研究中,临床使用性能研究较多,而有关生长因子和载体之间相互作用机制研究较少,而这是决定活性生长因子缓释过程的主要因素。同时缓释体在促进成骨活性过程中的影响因素也需要系统研究。有鉴于此,本项目采用壳聚糖和硫酸葡聚糖制备单一和复合微球,利用共振光散射光谱和荧光光谱法研究生长因子(重组人骨形态发生蛋白-2)和微球载体聚合物(壳聚糖、硫酸葡聚糖)之间的相互作用机理及其对重组人骨形态发生蛋白-2释放过程的影响,阐明重组人骨形态发生蛋白-2释放过程中的热力学和动力学控制过程及复合微球缓释机制；研究微球粒子形态结构、粒子尺寸及分布控制方法以及他们对包裹药物的负载率及释放过程的影响,揭示载药载体的功能化形态结构对重组人骨形态发生蛋白-2释放过程的调控；并通过细胞实验和动物实验,研究硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖复合微球释放过程及其骨诱导效应。本项目的研究成果对骨缺损的人工修复提供新思路和理论指导。研究目的：1.制备壳聚糖/硫酸葡聚糖纳米微球,对硫酸葡聚糖/壳聚糖纳米微球的聚电解质复合过程进行研究,探讨了pH值、离子浓度等因素对壳聚糖、硫酸葡聚糖之间的相互作用的影响,分析载蛋白空白微球的径粒范围,为制备硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖微球提供理论依据。2.制备硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球,观察微球的形态,并对微球的径粒、分散度进行研究,计算蛋白包封率、载药率,绘制缓释曲线。3.对硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球的聚电解质复合过程进行研究,探讨了pH值、离子浓度等因素对重组人骨形态发生蛋白-2、壳聚糖、硫酸葡聚糖之间的相互作用的影响,结合缓释曲线,分析缓释机制。4.评估硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球的生物安全性,为硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球的临床应用及骨诱导活性研究提供理论依据。5.设计细胞学实验,评估硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球体外对骨髓间充质干细胞的成骨诱导活性,并与空白微球组、游离重组人骨形态发生蛋白-2组组进行对比,从细胞学的角度评估两种微球成骨效应的异同。6.统计学处理：计量资料的统计描述用均数±标准差表示,运用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较用单因素方差分析,方差齐时组间多重比较用LSD-t检验法,若方差不齐则应用Games-Howell法。P<0.05认为差异有统计学意义。研究方法：1.应用离子交联法制备壳聚糖/硫酸葡聚糖纳米微球,采用共振光散射法研究pH值、离子浓度等因素对硫酸葡聚糖、壳聚糖之间的相互作用的影响,应用扫描电镜和Zeta电位分析载蛋白空白微球的径粒范围,为复和硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖微球提供理论依据。2.应用离子交联法制备硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球,采用扫描电镜和原子力显微镜观察微球的形态,并对微球的径粒、分散度进行研究,应用重组人骨形态发生蛋白-2试剂盒计算蛋白包封率、载药率,绘制缓释曲线。3.采用共振光散射法对硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球的聚电解质复合过程进行研究,应用共振光散射法探讨pH值、离子浓度等因素对重组人骨形态发生蛋白-2、壳聚糖、硫酸葡聚糖之间的相互作用的影响,结合缓释曲线,分析缓释机制。4.按照国家标准植入材料的生物安全评估实验对硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球的生物毒性进行评估,复苏并传代培养鼠成纤维细胞,进行硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球和硫酸葡聚糖/壳聚糖空白微球的细胞毒性实验,设置对照组,对其生物安全性进行评估。5.设计细胞学实验,体外传代培养SD大鼠的骨髓间充质干细胞,加入硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球、硫酸葡聚糖/壳聚糖空白微球、重组人骨形态发生蛋白-2,通过MTT检测法研究硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球体外对骨髓间充质干细胞的成骨诱导活性,并与空白微球组、重组人骨形态发生蛋白-2组、阴性对照组进行对比分析。研究结果：1.应用离子交联法制备硫酸葡聚糖纳/聚糖纳米微球,扫描电镜和原子力显微镜下提示微球成球良好,形态规整,分散度好,平均径粒为210nm,硫酸葡聚糖/壳聚糖纳米微球复合溶液的RLS强度在外界条件刺激如改变溶液pH和添加金属离子时会发生急剧的变化。在常温状态下,硫酸葡聚糖纳和壳聚糖可结合为聚电解质复合物。2.应用离子交联法成功制备硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖微球,CS/DS/rh-BMP-2纳米微球分布均匀,平均粒径为(217±8)nm,微球包封率和载药量分别为(85.6±3)%和(47.245±3.321)ug/mg。微球体外释放在2小时后出现一个突释放期,2天后释放度达高峰,之后缓慢下降,释放周期约28天。3.应用共振光散射的方法研究CS、DSS、与rhBMP-2之间的关系,结果表明,CS与rhBMP-2之间的相互作用弱,主要作用力为范德华力,DSS与rhBMP-2之间存在肝素结合位点,有较强的相互作用。在制备的过程中,rhBMP-2与DSS优先结合,而在缓释过程中,与CS结合的rhBMP-2会优先释放。4.按照国家标准植入材料的生物安全评估实验对硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球的生物毒性进行评估,复苏并传代培养鼠成纤维细胞,细胞毒性试验提示硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖生物相容性好,无明显细胞毒性。壳聚糖/硫酸葡聚糖纳空白微球载体的生物相容性可靠,无细胞毒性,是良好的蛋白载体。5.体外传代培养SD大鼠的骨髓间充质干细胞,加入硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球、壳聚糖/硫酸葡聚糖纳空白微球、重组人骨形态发生蛋白-2进行培养,发现硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球体和游离重组人骨形态发生蛋白在实验浓度下对骨髓间充质干细胞的增殖效应促进不明显。对骨髓间充质干细胞的分化效应有明显的促进作用,培养3d内,硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球提高骨髓间充质干细胞ALP含量的作用低于游离重组人骨形态发生蛋白-2,但5d后,硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球有效控制重组人骨形态发生蛋白-2的释放,使得硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖纳米微球促进骨髓间充质干细胞的分化的效应明显强于游离重组人骨形态发生蛋白-2组,有统计学意义(P<0.01)。光学显微镜下观察钙结节的生长情况发现7d后,硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖组的钙结节生长情况明显好于游离重组人骨形态发生蛋白-2组,促进骨髓间充质干细胞分化作用明显。结论应用离子交联法制备硫酸葡聚糖纳/壳聚糖纳米微球,微球成球良好,形态规整,分散度好,并表现出了良好的缓释性能。利用共振光散射光谱和荧光光谱法研究生长因子(重组人骨形态发生蛋白-2)和微球载体聚合物(壳聚糖、硫酸葡聚糖)之间的相互作用机理及其对重组人骨形态发生蛋白-2释放过程的影响,阐明重组人骨形态发生蛋白-2释放过程中的热力学和动力学控制过程及复合微球缓释机制；研究微球粒子形态结构、粒子尺寸及分布控制方法以及他们对包裹药物的负载率及释放过程的影响,揭示载药载体的功能化形态结构对重组人骨形态发生蛋白-2释放过程的调控；并通过体外细胞毒性实验和细胞增殖分化实验证实,硫酸葡聚糖/重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖复合微球骨诱导效应满意。本项目的研究成果对骨缺损的人工修复提供新思路和理论指导。

全文目录

摘要  3-11
ABSTRACT  11-26
第一章 CS/DSS微球的制备及CS、DSS相互作用关系的研究  26-46
  1 实验部分  27-29
  2 共振散射实验原理  29-31
  3 结果与讨论  31-39
  4 讨论  39-41
  参考文献  41-46
第二章 CS/DSS/rhBMP-2缓释微球的制备及体外释放试验研究  46-59
  1 材料和方法  48-49
  2 实验方法  49-51
  3. 统计学方法  51
  4 结果  51-55
  5. 讨论  55-56
  参考文献  56-59
第三章共振光散射法DSS/rhBMP-2/CS纳米微球的聚电解质复合过程的研究  59-85
  1. 主要试剂和仪器  61-62
  2 试验方法  62-64
  3. 结果与讨论  64-78
  4. 讨论  78-81
  参考文献  81-85
第四章 CS/DSS/rhBMP-2缓释体体外细胞毒性实验  85-97
  1 实验仪器与试剂  85-87
  2. 实验方法  87-89
  3. 统计学处理  89-90
  4. 实验结果  90-92
  5 讨论  92-94
  参考文献  94-97
第五章 CS/DSS/rhBMP-2缓释体成骨诱导实验研究  97-117
  1. 实验仪器与试剂  98-102
  2. 实验方法  102-104
  3. 统计学处理  104-105
  4. 实验结果  105-111
  5. 讨论  111-113
  参考文献  113-117
全文小结  117-123
本文的创新性和不足  123-125
成果  125-126
致谢  126-128

DSs/rh-BMP-2/CS复合微球的制备及成骨活性研究

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