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四氢嘧啶类化合物ZL-5015的抗炎作用及其作用机制研究

作　者: 夏鸿
导　师: 雷林生
学　校: 南方医科大学
专　业: 药理学
关键词: 四氢嘧啶类化合物 炎症介质 促炎细胞因子 抗炎
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的研究四氢嘧啶类化合物ZL-5015(1,3-二环戊基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸二乙酯)的抗炎镇痛作用及其作用机制。方法1.以丁炔二甲酸二乙酯、甲醛、环戊胺为原料,冰醋酸为催化剂,在乙醇溶剂中经氨基化作用、Mannich反应、亲核加成反应和脱氢环化反应等一步法合成四氢嘧啶类化合物ZL-5015。经柱层析分离纯化。2.采用二甲苯诱导小鼠耳郭肿胀模型,观察ZL-5015体内给药的抗炎作用。取BALB/c小鼠50只,随机均分为5组,分别为溶媒对照组,阿司匹林阳性药物组(100mg/kg.b.w)及化合物ZL-5015高、中、低剂量组(100、50、25mg/kg.b.w)。各组均用0.5%CMC-Na的水溶液配制。每日灌胃1次,连续给药3天。末次给药后1h,在每只小鼠右耳上均匀涂布二甲苯20μl致炎,40min后将小鼠颈椎脱臼处死,沿耳郭线剪下左、右耳片,用内径为7mm的打孔器分别在左、右耳相同位置打下耳片,称重,计算耳郭肿胀度。3.采用角叉菜胶诱导大鼠足趾肿胀模型,观察ZL-5015对大鼠体内给药的抗炎作用。取SD大鼠40只,随机均分为5组,分别为溶媒对照组,阿司匹林阳性药物组(100mg/kg.b.w)及化合物ZL-5015高、中、低剂量组(100、50、25mg/kg.b.w)。各组均用0.5%CMC-Na的水溶液配制。每日灌胃1次,连续给药3天。末次给药后1h,从大鼠右后足趾向远心端方向皮下注射高压灭菌的1%角叉菜胶生理盐水液0.1ml/只大鼠,并用记号笔在踝关节处做好标记,用大鼠足趾容积测量仪分别在注射1%角叉菜胶生理盐水液前(0h),及后1、2、3、4、5h时刻测定大鼠右后足容积。计算大鼠足趾肿胀度。4.采用醋酸诱导的小鼠扭体模型,观察ZL-5015体内给药的抗炎镇痛作用。取BALB/c小鼠50只,随机均分为5组,分别为溶媒对照组,阿司匹林阳性药物组(100mg/kg.b.w)及化合物ZL-5015高、中、低剂量组(100、50、25mg/kg.b.w)。各组均用0.5%CMC-Na的水溶液配制。每日灌胃1次,连续给药3天,末次给药后1h,按0.1ml/10g.b.w腹腔注射新配制的0.7%醋酸生理盐水液。观察并记录注射0.7%醋酸生理盐水液后20min内小鼠扭体次数。5.采用热板致痛模型,观察ZL-5015体内给药对小鼠的镇痛作用。取BALB/c小鼠若干只(大于50只),体重(20±2)g,雌性,实验前经50℃热板筛选剔除痛阈值大于30s或小于10s的动物,随机均分为5组,分别为溶媒对照组,曲马多阳性药物组(10mg/kg.b.w)及化合物ZL-5015高、中、低剂量组(100、50、25mg/kg.b.w)。各组均用0.5%CMC-Na的水溶液配制。每日灌胃1次,连续给药3天,末次给药后1h测定痛阈,以小鼠足部接触热板到开始舔后足的时间为痛阈值。观察并记录痛阂。6.采用MTT法检测ZL-5015对小鼠巨噬细胞和RAW264.7巨噬细胞代谢活力的影响。7.采用LPS (10μg/ml)刺激小鼠腹腔巨噬细胞以及RAW264.7巨噬细胞活化作为体外炎症模型,观察ZL-5015体外对腹腔巨噬细胞和RAW264.7巨噬细胞分泌炎症相关因子的影响。采用Griess试剂盒检测一氧化氮(NO)的含量；ELISIA法检测白细胞介素-1(IL-1p)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)的含量。8.采用LPS (10nμg/ml)刺激小鼠腹腔巨噬细胞以及RAW264.7巨噬细胞活化作为体外炎症模型,观察ZL-5015体外对腹腔巨噬细胞和RAW264.7巨噬细胞表达COX-2、iNOS mRNA的影响。实时荧光定量PCR法检测目的基因mRNA的相对含量(2-ΔCt,以GAPDH为内参)。结果一步法合成的四氢嘧啶类化合物ZL-5015(1,3-二环戊基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸二乙酯)经硅胶柱层析分离纯化,其结构经MS、1H-NMR和13C-NMR得到确证。化合物ZL-5015高、中剂量组(100、50mg/kg.b.w)均能明显抑制二甲苯诱导的小鼠耳郭肿胀,平均耳郭肿胀抑制率分别为49.2%、41.8%,与溶媒对照组比较有统计学意义(P=0.011、P=0.031)。测量时间为3h时,化合物ZL-5015在高、中、低剂量时(100、50、25mg/kg.b.w)对大鼠足趾肿胀均有明显抑制,平均抑制率分别为53.2%、41.3%、28.7%,与溶媒对照组比较有统计学意义(P=0.000、P=0.003、P=0.031)。化合物ZL-5015高、中、低剂量(100、50、25mg/kg.b.w)均能显著减少正常小鼠扭体反应次数,平均扭体反应抑制率分别为51.8%、39.6%、32.7%,与溶媒对照组比较有统计学意义(P=0.000、P=0.001、P=0.005)。化合物ZL-5015高、中、低剂量组(100、50、25mg/kg.b.w)可延长热板致小鼠疼痛的阈值,痛阈提高百分率分别为23.4%、13.0%、5.5%,但只有高剂量组与对照组相比有统计学意义(P=0.006)。在LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞6h后,培养上清中促炎细胞因子TNF-α及炎症介质PGE2的含量或LPS刺激24h后,促炎细胞因子IL-1β和炎症相关因子NO的含量大幅增加。化合物ZL-5015(40μM、20μM)组能部分抑制由LPS诱导的上述促炎细胞因子及炎症因子或介质的分泌,其对IL-1β、TNF-α、PGE2、NO的抑制率分别是：41.1%、29.1%(IL-1β);42.9%、33.8%(TNF-α);57%、45.15(PGE2)；67.1%.49.4%(NO),各指标均数与LPS组相比,差异有统计学意义(IL-1β:P=0.000、P=0.000;TNF-α:P=0.005、P=0.019；PGE2:P=0.001、 P=0.005:N0:P:=0.000、P=0.000)。化合物ZL-5015在80μM以上时对小鼠巨噬细胞的活力有明显抑制作用,抑制率为25.2%；浓度在40μM以下时,无明显抑制作用。80gM的ZL-5015能抑制小鼠巨噬细胞分泌IL-10,抑制率为66.3%；当其浓度在40μM以下时,能够轻度促进小鼠巨噬细胞IL-10的分泌,提高率分别为7.1%、6.1%。在LPS刺激RAW264.7巨噬细胞6h后,培养上清中促炎细胞因子TNF-α及炎症介质PGE2的含量或LPS刺激24h后,促炎细胞因子IL-1p和炎症相关因子NO的含量大幅增加。化合物ZL-5015(40μM、M.20μM)组能部分抑制由LPS诱导的上述促炎细胞因子及炎症因子或介质的分泌,其抑制率分别为：60.9%、36.2%(NO)；43.4%、28%(IL-1β):34.8%、26.3%(TNF-α)；66.5%、51.6%(PGE2)各指标均数与LPS组相比,差异有统计学意义(IL-1β:P=0.000、P=0.017； TNF-α:P=0.004、P=0.025;PGE2:P=0.000、P=0.002；NO:P=0.000.P=0.000)。80μM的ZL-5015对RAW264.7巨噬细胞的活力有明显的抑制作用,抑制率29.7%,且能抑制RAW264.7细胞分泌IL-10,抑制率为62.9%；当其浓度在80μM以下时,对RAW264.7细胞的活力无明显影响,但能轻度促进RAW264.7细胞分泌IL-10,提高率分别为4.0%、12.0%、7-0%。经过LPS体外刺激24h后,小鼠腹腔巨噬细胞COX-2、iNOS mRNA的表达明显增多,化合物ZL-5015(40μM、20μM)组可部分抑制由LPS诱导的上述目的基因mRNA的表达,抑制率分别为37.9%、29.1%(COX-2):41.5%.36.5%(iNOS),各指标均数与LPS组相比,差异有统计学意义(COX-2:P=0.001、 P=0.008；iNOS:P=0.000、P=0.01)；经过同样处理的RAW264.7巨噬细胞,化合物ZL-5015(40μM、20μM)组可部分抑制由LPS诱导的上述目的基因mRNA的表达,抑制率分别39.5%、31.6%(COX-2);38.5%、31.6%(NOS),各指标均数与LPS组相比,差异有统计学意义(COX-2:P=0.001、P=0.007；iNOS:P=0.001、P=0.001)。结论1.四氢嘧啶类化合物ZL-5015(1,3-二环戊基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸二乙酯)可以通过以丁炔二甲酸二乙酯、甲醛、环戊胺为原料,经氨基化作用、Mannich反应、亲核加成反应和脱氨基环化等多组分反应合成。该制备方法具有反应步骤简单,原料易得,反应条件温和,目标产物收率高等优点。反应粗产物可经硅胶柱层析,以正己烷：乙酸乙酯(V：V=1：7-1：4)为流动相分离纯化,操作简单、易行。2.化合物ZL-5015对二甲苯诱导的小鼠耳郭肿胀和角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀度均有抑制作用,提示其具有抗炎作用。3.化合物ZL-5015可以显著减少醋酸所致小鼠扭体次数并有一定的剂量依赖关系,提示其具有镇痛或抗炎活性。4.化合物ZL-5015在高剂量(100mg/kg.b.w)时可以延长热板法的痛阈值,提示其具有弱的中枢镇痛活性。5.化合物ZL-5015体外可部分抑制内毒素刺激巨噬细胞(小鼠腹腔巨噬细胞,RAW264.7巨噬细胞)IL-1β、IL-6、TNF-α促炎因子的分泌,提示其抗炎作用与抑制这些促炎症细胞因子的分泌有关。6.化合物ZL-5015体外可提高内毒素刺激巨噬细胞(小鼠腹腔巨噬细胞,RAW264.7巨噬细胞)培养上清中IL-10的含量,提示ZL-5015可通过提高IL-10的产生或分泌来抑制促炎细胞因子的产生,从而发挥抗炎作用。7.化合物ZL-5015可以显著抑制巨噬细胞(小鼠腹腔巨噬细胞,RAW264.7巨噬细胞)NO和PGE2的分泌,且呈现一定的剂量依赖性,提示其抗炎作用与抑制炎症介质的产生或分泌有关。8.化合物ZL-5015体外可部分抑制内毒素刺激巨噬细胞(小鼠腹腔巨噬细胞,RAW264.7巨噬细胞)COX-2和iNOS mRNA的表达,提示可通过抑制相关合成酶mRNA的表达减少NO、PGE2的产生,但对其mRNA表达的抑制率低于对NO、PGE2产生的抑制率,提示ZL-5015对iNOS、COX-2的酶活性亦有抑制作用或存在其他的作用机制,有待进一步研究。

全文目录


摘要  3-9
ABSTRACT  9-18
前言  18-26
第一章 四氢嘧啶类化合物ZL-5015的合成  26-31
  1 实验材料与方法  26-28
  2 结果  28-29
  3 讨论  29
  4 结论  29-31
第二章 ZL-5015抗炎作用的体内动物实验研究  31-41
  1 材料与方法  31-34
  2 结果  34-39
  3 讨论  39-40
  4 结论  40-41
第三章 ZL-5015抗炎作用的体外实验研究  41-68
  1 材料与方法  41-42
    1.1 实验动物  41
    1.2 药品与试剂  41
    1.3 主要仪器  41-42
  第一节 化合物ZL-5015对LPS激活小鼠腹腔巨噬细胞产生炎症相关因子的抑制作用  42-48
    1.4 实验方法  42-43
    1.5 化合物ZL-S015对小鼠腹腔巨睡细胞产生一氧化氮（NO)的影响  43-45
    1.6 化合物ZL-5015对小鼠腹腔巨唾细胞产生IL_ip、IL-6、IL-10和TNF-a的影响  45-46
    1.7 化合物ZL-5015对小鼠腹腔巨暖细胞产生PGEi的影响  46-47
    1.8 统计分析  47-48
  2 结果  48-56
    2.1 化合物ZL-5015对小鼠腹腔巨趣细胞产生一氧化氮(NO)的影响  48-49
    2.2 化合物ZL-5015对小鼠腹腔巨睡细胞产生IL-ip的影响  49-50
    2.3 化合物ZL-5015对小鼠腹腔巨睡细胞产生IL-6的影响  50-51
    2.4 化合物ZL-5015对小鼠腹腔巨唾细胞产生IL-10的影响  51-53
    2.5 化合物ZL-5015对小鼠腹腔巨唾细胞产生TNF-a的影响  53-54
    2.6 化合物ZL-5015对小鼠腹腔巨_细胞产生PGE2的影响  54-55
    2.7 化合物ZL-5015对小鼠腹腔巨唾细胞代谢活力的影响  55-56
  第二节 化合物ZL-5015对LPS激活RAW264.7巨噬细胞产生炎症相关因子的抑制作用  56-65
    2.1 实验方法  56-58
    2.2 统计分析  58
    2.3 结果  58-65
  3 讨论  65-67
  4 结论  67-68
第四章 化合物ZL-5015对炎症相关因子mRNA表达的抑制作用  68-81
  1材料与方法  68-69
    1.1 实验动物  68
    1.2 药品与试剂  68-69
    1.3 主要仪器  69
  第一节 ZL-5015对内毒素激活小鼠腹腔巨噬细胞表达炎症相关基因mRNA的抑制作用  69-74
    1.4 小鼠腹腔巨睡细胞的制备  69-70
    1.5 逆转录反应  70-71
    1.6 实时焚光定量PCR  71-73
    1.7 统计分析  73-74
  2 结果  74-76
    2.1 ZL"5015对内毒素诱导小鼠腹腔巨雄细胞表达环氧合酶-2 mRNA的抑制作用  74-75
    2.2 ZL-5015对内毒素诱导小鼠腹腔巨睡细胞表达诱导型一氧化氣合酶mRNA的抑制作用  75-76
  第二节 ZL-5015对内毒素激活RAW264.7巨噬细胞表达炎症相关基因mRNA的抑制作用  76-79
    2.1 RAW264.7巨唆细胞的制备  76-77
    2.2 实验分组与总RNA提取  77
    2.3 mRNA表达量的检测  77
    2.4 统计分析  77
    2.5 结果  77-79
  3 讨论  79-80
  4 结论  80-81
参考文献  81-88
附录  88-89
附图  89-92
攻读学位期间成果  92-93
致谢  93-94
学位论文原创性声明  94

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