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铜伴侣蛋白Atox1的铜转运及与铂类药物作用的机理研究

作　者: 郗照勇
导　师: 刘扬中
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物无机化学
关键词: Atox1 突变核磁共振铜转运铜结合铂类药物
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

铜是生命体必须的微量金属元素之一,但由于自由铜离子的毒性,铜在细胞内的迁移是通过蛋白-蛋白相互作用完成的。在人体内,铜伴侣蛋白Atoxl将铜转运至ATP7A和ATP7B的金属结合结构域,对维持细胞内的铜平衡具有至关重要的作用。通过蛋白质识别作用,铜可以在Atox1与其靶蛋白的保守的CxxC金属结合基序之间进行转移。除了铜结合基序外,非金属结合的保守残基同样能决定Atox1的铜结合和转移性质。K60A突变促进了铜螯合剂二辛可宁酸诱导的Atox1的铜解离。Lys60的突变还会削弱Atox1与其靶蛋白之间复合物的形成进而减少了铜的转移。近来的研究显示Atox1还是铜依赖的核转录因子,这个新功能可以激活细胞的增殖并能够缓解心血管系统的氧化应激。Atox1的功能多样性使其成为潜在的药物靶体。金属药物四硫钼酸盐能够作用于Cu1-Atox1治疗铜代谢紊乱。大量证据显示铜转运蛋白能介导铂类金属药物的摄取和泵出,并与顺铂的耐药性相关。Atox1也被证明能在体外及细胞内与顺铂相互作用。本论文围绕Atox1在维持细胞内铜平衡和铂类药物耐药性机理两个方面的作用,研究了Atox1的铜结合和转移机制及其与铂类化合物的相互作用。第一章首先对Atox1与细胞内的铜平衡进行了文献综述,包括细胞内铜的摄取与平衡、Atox1的结构和功能及其与ATP7A和ATP7B的相互作用等。然后介绍了铜转运蛋白与铂类药物的作用,包括铂类药物机理的研究现状、hCtr1促进铂类药物的摄取、ATP7A和ATP7B对铂类药物的泵出及Atox1与铂类药物的作用等。第二章利用液体核磁共振方法系统的研究了Atox1K60A突变体的结构和动力学性质,并通过与野生型蛋白比较来阐述保守残基Lys60调节Ato1铜转运的机制。结果显示K60A突变会导致细微但重要的二级结构重组及铜结合残基的侧链取向变化。蛋白质的动力学研究表明K60A突变促进了整体结构的柔韧性,造成了铜结合位点处弛豫行为的显著差异。与文献报道相比,核磁滴定实验发现,野生型Atox1及K60A突变体均能够通过快速交换的方式将铜转移至靶蛋白,而自由铜与Atox1的结合则是慢交换过程。另外,在铜转移实验中均检测到铜诱导的异源蛋白复合物的形成。不过,突变体与野生型蛋白的铜转移识别动力学过程有着明显的差异。因此,Lys60通过维持Atox1尤其是铜结合区域的结构和动力学性质来调节Atox1的铜结合及与靶蛋白的识别。第三章通过液体核磁共振及质谱等实验详细研究了铜结合对Atox1与不同铂类化合物(cisplatin、trans-EE和trans-PtTz)反应的影响。结果显示铜结合能够显著促进Atox1与不同构型铂类化合物的铂化反应速率。串联质谱分析表明铜配位残基(Cys12和Cys15)是三个铂化合物的主要结合位点。反式铂化合物与apo-Atox1及CuI-Atox1的反应均要远远快于顺铂的反应。然而,顺铂诱导形成的Atox1的聚集体更多。这些差异可能与不同铂化合物反应形成的铂化产物不同相关。载体配体的离去仅在顺铂的反应中发生。另外,铜结合能够调节巯基分子DTT和GSH在Atox1铂化反应中的作用。在顺铂与Atox1的反应中,铜的存在大大抑制了DTT和GSH与顺铂复合物的形成。但铜结合却促进了反式铂化合物从Atox1到DTT或GSH的转移。这些发现表明铜离子可能对不同构型的铂类化合物在细胞内的迁移有着不同的调节作用。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-12
第一章绪论  12-42
  1.1 铜伴侣蛋白Atox1与细胞内的铜平衡  12-22
    1.1.1 引言  12
    1.1.2 铜的细胞摄取与平衡  12-14
    1.1.3 铜伴侣蛋白Atox1  14-22
  1.2 铜转运蛋白与铂类抗肿瘤药物  22-31
    1.2.1 引言  22-23
    1.2.2 DNA是顺铂的主要作用靶点  23-24
    1.2.3 蛋白质与铂类药物的作用  24-25
    1.2.4 铜转运蛋白与铂类药物的作用  25-31
  参考文献  31-42
第二章保守残基调节Atox1性质的结构和动力学研究  42-78
  2.1 引言  42-43
  2.2 实验材料和方法  43-51
    2.2.1 分子克隆、蛋白质的表达及纯化  43-49
    2.2.2 核磁共振谱图的采集、数据处理和结构计算  49-50
    2.2.3 氢氘交换实验及数据处理  50
    2.2.4 主链~(15)N弛豫分析  50-51
    2.2.5 核磁滴定实验  51
  2.3 实验结果和讨论  51-73
    2.3.1 Atox1 wild-type与突变体蛋白的~1H-~(15)N HSQC谱图比较  51-53
    2.3.2 K60A突变体蛋白的化学位移认证  53
    2.3.3 K60A突变体的结构计算  53-55
    2.3.4 K60A突变体的结构及其与野生型蛋白结构的比较  55-57
    2.3.5 K60A突变导致的化学位移扰动  57-58
    2.3.6 K60A突变体与野生型蛋白的氢氘交换动力学比较  58-60
    2.3.7 K60A突变体与野生型蛋白的~(15)N主链弛豫动力学比较  60-63
    2.3.8 K60A突变体的铜结合性质研究  63-67
    2.3.9 野生型蛋白与K60A突变体的铜转移性质比较  67-71
    2.3.10 讨论  71-73
  2.4 本章总结  73-74
  参考文献  74-78
第三章铜结合调节Atox1与铂类化合物的作用  78-122
  3.1 引言  78-80
  3.2 实验材料和方法  80-83
    3.2.1 铂类化合物的合成  80
    3.2.2 分子克隆、蛋白质的表达及纯化  80
    3.2.3 分子筛检测Atox1与铂类化合物的作用  80-81
    3.2.4 NMR实验  81-82
    3.2.5 电喷雾质谱(ESI-MS)实验  82
    3.2.6 Tricine-SDS-PAGE  82-83
  3.3 实验结果和讨论  83-116
    3.3.1 Atox1与铂化合物反应的初步探索  83-86
    3.3.2 ~1H-~(15)N HSQC方法监测顺铂与Atox1的作用  86-90
    3.3.3 ESI-MS方法研究顺铂与Atox1复合物的种类和转化过程  90-92
    3.3.4 酶解及串联质谱检测铜结合对顺铂结合位点的影响  92-94
    3.3.5 反式铂化合物与Atox1作用的NMR研究  94-99
    3.3.6 ESI-MS方法研究反式铂化合物与Atox1复合物的种类、转化过程及铂结合位点  99-105
    3.3.7 Tricine-SDS-PAGE方法研究铂化诱导的Atox1的聚集  105-106
    3.3.8 GSH存在下铂类化合物与Atox1的作用  106-114
    3.3.9 讨论  114-116
  3.4 本章总结  116-117
  参考文献  117-122
致谢  122-123
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果  123-124

铜伴侣蛋白Atox1的铜转运及与铂类药物作用的机理研究

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