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高强度聚焦超声辐照后的活体兔眼生物学变化

作　者: 瞿贤桂
导　师: 杜之渝
学　校: 重庆医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 高强度聚焦超声热效应角膜基质胶原纤维焦域免疫组化 HE染色
分类号: R772.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：应用一定剂量的高强度聚焦超声（High Intensity FocusedUltrasound,HIFU）以圆环状定位辐照活体兔角膜周边基质，于术后不同时间段光镜下观察角膜及视网膜的组织形态学变化，电镜下观察角膜基质胶原纤维及细胞的变化情况，采用免疫组化方法检测CollagenⅢ及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在角膜的表达。探讨HIFU作用于兔角膜基质后引起的生物学效应及组织的损伤修复过程，为HIFU应用于活体角膜的安全性研究提供实验依据。方法：1.治疗参数的选择：实验所用CZF型超声波治疗仪工作频率为1000Hz，脉冲10.20，将HIFU辐照活体兔角膜周边基质的模式设计为直径9mm的圆环状，辐照时间为6s（电动机带动HIFU治疗头匀速旋转一圈所需时间）。在相同治疗时间及旋转直径下分别以功率0.5w，1.0w，1.5w，2.0w定位辐照活体兔角膜周边基质，辐照完后于术后1天处死实验动物并取角膜标本，分别行角膜组织切片HE染色，光镜下观察角膜组织切片，如HIFU辐照后所形成的焦域大小、形状及各层结构的有无损伤等情况，并从中选出一组适合的辐照剂量作为下一步动态观察研究的治疗参数。2.HIFU辐照活体兔角膜动物模型的构建及辐照后活体兔角膜、视网膜的组织学动态观察：将7只健康无眼部疾患的新西兰大白兔随机分为对照组1只，实验组6只。将选定的治疗参数定位辐照实验组兔眼周边角膜基质（6只12眼），辐照完后于不同时间段（术后1，3,10,30,60,90天）行兔眼裂隙灯观察；光镜下角膜及视网膜组织切片观察；电镜下角膜辐照处基质胶原纤维及细胞结构观察；并用免疫组织化学方法检测CollagenⅢ，α-SMA在角膜的表达。对照组不行HIFU辐照，余处理（裂隙灯检测，光镜，电镜，免疫组化等）同实验组。结果:1.通过预实验选定1w作为HIFU辐照活体兔角膜的治疗功率。2.裂隙灯观察结果：HIFU辐照活体兔角膜后立即在基质层形成灰白色圈，灰白色圈与周边正常组织分界清楚，辐照圈于术后10天逐渐变淡消失，角膜恢复透明。3.角膜组织切片HE染色结果：术后1天可见HIFU辐照后在角膜基质内形成生物学焦域[6]（Biological Focal Region，本实验中指HIFU辐照角膜基质后引起的纤维改变范围）呈椭圆形蓝色深染，边界清楚，长径约占角膜基质厚度70%。上皮层及内皮层完整。术后10天蓝色深染逐渐变淡，范围缩小，至术后30天时渐趋消失。术后10天至60天角膜组织切片HE染色后均可见辐照处基质纤维排列紊乱，基质层收缩变薄，上皮增生，未辐照处角膜组织形态较术前未见明显改变。术后90天基质纤维排列基本整齐平行，上皮增生明显减轻，组织形态渐趋恢复。4．角膜组织免疫组化结果：正常角膜中可见CollagenⅢ在角膜上皮层，基质层，内皮层均有表达，α-SMA在正常角膜中未见表达。HIFU辐照后角膜辐照处CollagenⅢ，α-SMA的表达均于术后3天逐渐增加，术后30天达高峰，至术后60天逐渐减少，术后90天时趋于平稳。周围区域角膜组织无明显变化。5.视网膜组织切片HE染色结果：光镜下可见对照组视网膜大致分为杆体椎体层，外界膜层，外颗粒层，外网状层，内颗粒层，内网状层，神经节细胞与神经纤维层，内界膜层，无色素细胞层。视网膜各层排列致密，整齐，视网膜节细胞层核清楚；视网膜各层间界限较为清晰，内核层及外核层细胞排列整齐致密。术后各时间段视网膜组织切片HE染色观察结果较术前未见明显变化。6.电镜下角膜超微结构观察：正常角膜内可见角膜基质层为交叉排列的板层纤维束，基质细胞存在于板层纤维之间，胞体呈长梭形，胞核呈长椭圆形，长径与细胞一致，内含染色质，胞质内可见内质网，线粒体，高尔基体等细胞器。术后1月时可见辐照处基质板层纤维束有断裂现象，成纤维细胞活化，胞浆内线粒体肿胀甚至溶解，粗面内质网数量增加。术后3月时基质层胶原纤维断裂现象消失，活化细胞减少，线粒体形态恢复正常，粗面内质网数量减少。结论：1.合适剂量的HIFU辐照活体兔角膜基质定位准确，不损伤焦域外组织，辐照过程中不损伤角膜上皮及内皮，将手术本身对角膜的损伤降至最低且减少感染的机会。2.HIFU辐照活体兔角膜基质术后10天至60天辐照区组织形态学改变明显，至术后90天辐照区组织形态学改变渐趋恢复。治疗及术后观察过程中未出现角膜新生血管、角膜穿孔等现象。表明HIFU应用于角膜具有较好的安全性及可行性。3.HIFU辐照后角膜中CollagenⅢ及α-SMA表达量增加，因CollagenⅢ及α-SMA参与角膜的损伤修复过程，说明HIFU辐照角膜基质对角膜造成一定程度的热损伤，术后诱发角膜成纤维细胞活化，新生胶原产生等修复重塑过程。4.电镜下见辐照处角膜基质层术后1月胶原纤维断裂，基质细胞内线粒体肿胀溶解等，说明1w/9mm组剂量HIFU的热效应对角膜组织具有一定破坏作用。而同时可见成纤维细胞活化，胞质内粗面内质网丰富，表明新生胶原合成旺盛，与术后1月CollagenⅢ及α-SMA大量表达等免疫组化结果一致。5.术后不同时间段视网膜组织切片观察结果与对照组未见明显差异。表明从组织学方面来看HIFU辐照角膜对视网膜组织形态无明显影响。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-6
摘要  6-10
ABSTRACT  10-13
前言  13-15
第一部分高强度聚焦超声辐照活体兔角膜治疗参数的选择  15-20
  1 材料与方法  15-18
  2 结果  18
  3 讨论  18-19
  4 小结  19-20
第二部分高强度聚焦超声辐照后兔角膜及视网膜生物学变化的研究  20-28
  1 材料与方法  20-22
  2 结果  22-25
  3 讨论  25-27
  4 小结  27-28
全文结论  28-29
参考文献  29-30
附图  30-35
文献综述  35-41
  参考文献  39-41
致谢  41-42
攻读硕士学位期间发表的文章  42-43

高强度聚焦超声辐照后的活体兔眼生物学变化

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