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FAT10介导miR-34a对肝癌放疗敏感性作用的研究

作　者: 蒋成行
导　师: 邵江华
学　校:
专　业: 外科学
关键词: 原发性肝细胞癌 FAT10 miR-34a Bcl-2 Bax 放疗敏感性
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：通过RNA干扰特异性下调肝癌细胞HepG2及MHCC-97H中FAT10基因的表达，探讨FAT10对miR-34a的调控及对肝癌细胞放疗敏感性作用的影响。方法：1、将针对FAT10的siRNA转染到肝癌细胞株HepG2和MHCC-97H中，通过荧光定量PCR和western blot检测FAT10mRNA和蛋白的表达变化情况。2、将细胞分成：control，siRNA（－），FAT10-siRNA,电离辐射（IR）,IR＋siRNA（－）,IR＋FAT10-siRNA六组，通过荧光定量PCR检测miR-34a表达，Western blot检测Bcl-2及Bax蛋白的表达变化。3、绘制细胞生长曲线及流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。结果：1、干扰FAT10后肝癌细胞的FAT10mRNA和蛋白的表达受到明显抑制，2、实时荧光定量PCR及Western blot结果显示FAT10-siRNA组、IR＋siRNA（－）组和IR组的miR-34a表达明显升高，Bcl-2的蛋白表达明显降低，Bax蛋白表达明显增高，而IR+FAT10-siRNA组表达变化更加明显3、流式细胞仪检测表明干扰FAT10使细胞阻滞在G0/G1期，IR照射使细胞阻滞在G2/M期。并且干扰FAT10和IR都可诱发细胞凋亡，而IR+FAT10-siRNA组凋亡更为明显。结论：干扰FAT10后miR-34a表达明显升高、Bcl-2的蛋白表达明显降低、Bax蛋白表达明显增高，从而明显增强肝癌细胞的放疗敏感性。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第1章引言  8-11
第2章材料与方法  11-30
  2.1 细胞株  11
  2.2 主要试剂  11-12
  2.3 自配试剂  12-14
  2.4 主要仪器设备  14-15
  2.5 实验方法  15-16
  2.6 siRNA 瞬时转染 HepG2 细胞及 MHCC-97H 细胞后 mRNA 的检测  16-21
    2.6.1 设计合成针对 FAT10 基因的 siRNA 序列  16-17
    2.6.2 实时荧光定量 PCR 分析瞬转后细胞 FAT10 mRNA 的变化  17-21
  2.7 Western blot 检测 FAT10 蛋白表达变化  21-24
    2.7.1 细胞蛋白提取  21
    2.7.2 BCA 法测定蛋白浓度  21-22
    2.7.3 SDS－PAGE 凝胶电泳  22-23
    2.7.4 转膜  23
    2.7.5 免疫反应  23-24
    2.7.6 蛋白检测  24
  2.8 实时荧光定量 PCR 检测 miR-34a 表达水平  24-27
    2.8.1 细胞照射  24
    2.8.2 miRNA 的提取  24-25
    2.8.3 合成 miRNA 的 cDNA  25-26
    2.8.4 实时荧光定量 PCR 检测 miR-34a 的表达水平  26-27
  2.9 Western blot 分析肝癌细胞 HepG2 和 MHCC97H 内 Bcl-2 及 Bax 蛋白表达水平  27
  2.10 细胞计数法绘制细胞生长曲线  27-28
  2.11 流式细胞术检测分析细胞周期的改变情况  28
  2.12 流式细胞术检测分析细胞凋亡的改变情况  28-29
  2.13 统计学分析  29-30
第3章结果  30-36
  3.1 转染 FAT10-siRNA 至肝癌细胞检测 FAT10 的表达  30-31
  3.2 干扰 FAT10 后肝癌细胞中 miR-34a 的表达变化  31
  3.3 干扰 FAT10 后肝癌细胞中 Bcl-2 和 Bax 的表达变化  31-32
  3.4 细胞生长曲线的变化  32
  3.5 流式细胞术分析细胞周期及凋亡变化  32-36
第4章讨论  36-39
第5章结论  39-40
致谢  40-41
参考文献  41-44
攻读学位期间的研究成果  44-45
综述  45-53
  参考文献  50-53

FAT10介导miR-34a对肝癌放疗敏感性作用的研究

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