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假基因Cripto-3在人大肠癌发生发展中作用及机制探讨

作　者: 蒋鹏程
导　师: 赵浩亮
学　校: 山西医科大学
专　业: 外科学
关键词: 大肠癌假基因 Cripto-3 增殖、侵袭小干扰RNA
分类号: R735.34
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景与目的：由于与功能基因的紧密相关性以及在基因组进化过程中的重要性,假基因功能已引起了国内外学者的广泛注意。我们前期研究发现Cripto-1基因在许多恶性肿瘤中高表达,且呈现出大肠癌器官特异性肝转移的特性,但是其假基因Cripto-3(Cr-3)在大肠癌中的作用和机制尚不清楚。本研究首先观察并初步了解假基因Cripto-3在人大肠癌发生发展中的作用,并探讨Cripto-3表达对大肠癌细胞生长、克隆形成及侵袭的影响。并进一步从基质金属蛋白酶角度探讨了Cr-3调控癌细胞生物学行为的分子机制。方法：1,收集人大肠癌和正常大肠黏膜组织,采用荧光实时定量PCR方法检测组织中mRNA水平,并分析其表达水平与淋巴结转移、临床分期的相关性。培养大肠癌细胞株,采用荧光实时定量PCR方法检测各细胞株中mRNA不同表达水平,并选择Cripto-3表达最高者SW-620细胞和最低者HCT-116细胞为下一步研究对象。2,构建Cr-3真核表达质粒和Cr-3小干扰RNA(siRNA)。HCT-116细胞分为3组：空白对照组(Con-A)、空载质粒对照组(Con-B)和Cr-3过表达质粒组(Cr-3),其中,Cr-3组以Cr-3真核表达质粒转染处理。分别用MTT法和平板克隆试验检测各组癌细胞生长能力,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力,并作统计学处理。3,构建并用化学方法合成Cr-3siRNA。SW-620细胞分为3组：空白对照组(con-a)、空载质粒对照组con-b和Cr-3siRNA组(siRNA),其中,siRNA组以Cr-3siRNA转染处理。分别用MTT法和平板克隆试验检测各组癌细胞生长能力,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力,并作统计学处理。4,为进一步深入探讨Cr-3在大肠癌发生发展中的作用和分子机制,本课题组进一步采用荧光实时定量PCR方法和蛋白质印迹方法检测2、3各实验组基质金属蛋白酶家族中MMP-2, MMP-7和MMP-9基因mRNA和蛋白水平。结果：1,在政策大肠黏膜组织中,Cr-3mRNA水平极低,在大肠癌组织中,Cr-3mRNA呈高表达,统计学分析,差异十分显著(P<0.01);Cr-3mRNA高表达与癌细胞侵袭和淋巴结转移密切相关,而与组织类型无关；在4株大肠癌细胞株中,Cr-3mRNA均有不同程度的表达,其中HCT-116中Cr-3mRNA最低,SW-620细胞中最高；2,以Cr-3真核表达质粒转染Cr-3低表达者大肠癌HCT-116细胞株,MTT结果显示,72h Con-A、Con-B和Cr-3组相对增值率分别为0.761±0.026、0.764±0.034和0.848±0.008(P<0.05);平板克隆结果显示,Con-A、Con-B和Cr-3组分别为75±6、76±5和119±3(P<0.05)；Transwell结果显示,Con-A、Con-B和Cr-3组穿膜细胞数分别为444±4、45±5和76±6(P<0.05);3,以Cr-3siRNA转染大肠癌SW620细胞株后,MTT结果显示,72h con-a、con-b和siRNA组相对增殖率分别为0.927±0.037、0.922±0.035和0.663±0.018(P<0.05)；平板克隆结果显示,con-a、con-b和siRNA组分别为23±3、24±3和12±3(P<0.05)；Transwell结果显示,con-a、con-b和siRNA组穿膜细胞数分别为38±4、40±3和8±1(P<0.05)；4,荧光实时定量PCR和蛋白质印迹结果显示,与大肠癌HCT-116细胞Con-A组比较,Cr-3过表达组MMP-2、MMP-7和MMP-9mRNA和蛋白水平明显升高；,与大肠癌SW620细胞con-a组比较,siRNA转染组MMP-2、MMP-7和MMP-9mRNA和蛋白水平明显均明显下调。结论：1,假基因Cr-3在大肠癌中过表达,并与癌细胞的侵袭、转移密切相关；2, MMPs家族成员MMP-2、-7和-9在Cr-3调控大肠癌细胞侵袭和转移中发挥着重要作用；3,假基因Cr-3可能是大肠癌基因诊断和治疗中重要靶点之一,深入探讨其作用和分子机制,将有助于提高转移性大肠癌的综合诊疗水平。

全文目录

英文缩写词索引  8-9
中文摘要  9-11
ABSTRACT  11-14
前言  14-15
资料与方法  15-44
  1 资料  15-17
    1.1 组织标本  15
    1.2 大肠癌细胞株  15-16
    1.3 主要试剂与耗材  16
    1.4 主要仪器与设备  16-17
  2 方法  17-31
    2.1 Cr-3真核表达质粒的构建  17-21
    2.2 Cr-3 siRNA的设计和合成  21
    2.3 大肠癌组织Cr-3 mRNA水平检测  21-25
    2.4 大肠癌细胞Cr-3 mRNA检测  25
    2.5 Cr-3真核表达质粒或siRNA转染大肠癌细胞  25-26
    2.6 转染后Cr-3基因检测  26
    2.7 MTT检测细胞增殖  26-27
    2.8 Colony formation法检测细胞增殖  27
    2.9 Transwell法检测细胞侵袭能力  27
    2.10 癌细胞10MMP-2、-7和-9检测  27-31
  3 统计学方法  31-32
  4 结果  32-44
    4.1 Cr-3定量PCR体系的构建  32
    4.2 大肠癌组织Cr-3 mRNA水平  32-33
    4.3 大肠癌细胞株中Cr-3 mRNA水平  33-34
    4.4 Cr-3真核表达质粒构建  34-35
    4.5 Cr-3质粒转染对大肠癌HCT-116细胞增殖的影响  35-36
    4.6 Cr-3质粒转染对大肠癌HCT116细胞平板克隆形成的影响  36-37
    4.7 Cr-3质粒转染对大肠癌HCT116细胞侵袭的影响  37-38
    4.8 Cr-3 siRNA的筛选  38
    4.9 Cr-3 siRNA转染对大肠癌SW620细胞增殖的影响  38-39
    4.10 Cr-3 siRNA转染对大肠癌SW620细胞平板克隆形成的影响  39-40
    4.11 Cr-3 siRNA转染对大肠癌SW620细胞侵袭的影响  40-41
    4.12 Cr-3质粒转染对大肠癌HCT116细胞MMP-2、-7和-9基因的影响  41-42
    4.13 Cr-3 siRNA转染对大肠癌SW620细胞MMP-2、-7和-9基因的影响  42-44
讨论  44-51
  1 大肠癌诊疗现状  44
  2 假基因渊源、发现  44-45
    2.1 假基因的历史渊源  44-45
    2.2 假基因的发现和研究  45
  3 假基因功能研究进展  45-47
  4 假基因在肿瘤研究中进展  47-48
  5 Cr-3在大肠癌组织和细胞中mRNA水平  48-49
  6 Cr-3调控大肠癌分子机制初探  49-50
  7 结论  50-51
参考文献  51-60
综述  60-70
  参考文献  64-70
个人简历  70-72
致谢  72

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