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DJ-1-shRNA真核表达载体的构建及其对转染的SGC7901胃癌细胞DJ-1的影响

作　者: 黄雁
导　师: 张江南
学　校:
专　业: 外科学
关键词: DJ-1 真核表达 pGPU6/GFP/Neo SGC7901胃癌细胞
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，以DJ-1为靶基因，设计构建DJ-1-shRNA真核表达载体，进行测序鉴定，通过转染SGC7901胃癌细胞，检测该表达质粒对SGC7901胃癌细胞DJ-1基因表达的影响，为进一步研究DJ-1是否参与胃癌细胞的侵袭迁移、建立动物模型研究胃癌腹膜转移的分子机制奠定前期实验基础。方法：利用GeneBank中人DJ-1基因序列（NM₀07262）作为分析序列，依据http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html上的设计原则，设计了靶向DJ-1基因的3条候选RNA干扰序列，与shRNA真核表达载体pGPU6/GFP/Neo构建重组质粒；同时设计并构建阴性对照RNA干扰重组载体，用于鉴定pGPU6/GFP/Neo质粒介导的RNA干扰体系的特异性，并对重组载体进行测序鉴定。将重组质粒转化Top10感受态大肠杆菌进行克隆，将克隆得到的重组质粒通过脂质体转染SGC7901胃癌细胞，采用RT-PCR，Western Blot法检测细胞中DJ-1mRNA和蛋白的表达。结果：重组质粒转化Top10大肠杆菌经氨苄青霉素抗性筛选可见有细菌克隆长出。经测序分析证实，靶向DJ-1基因的3个pGPU6/GFP/Neo-shRNA重组载体及阴性对照RNA干扰重组载体构建成功，分别命名为pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-A，pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-B，pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-C，pGPU6/GFP/Neo-shNC。RT-PCR法检测结果显示：pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-C转染组瞬时转染后靶基因DJ-1表达的抑制效果最强达78%以上，第2组阴性对照重组载体转染后DJ-1基因的表达无明显变化（P<0.01）；Westernblot法检测结果显示：pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-C转染组瞬时转染后靶基因DJ-1表达的抑制效果最强达75%以上，第2组阴性对照重组载体转染后DJ-1基因的表达无明显变化（P<0.01）。结论：成功构建了DJ-1-shRNA真核表达载体，pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-C可明显抑制SGC7901胃癌细胞DJ-1基因的mRNA和蛋白水平的表达。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
中英文缩略词表  9-11
第1章引言  11-13
第2章材料与方法  13-28
  2.1 主要试剂及材料  13-14
  2.2 主要仪器和设备  14-15
  2.3 主要试剂的配制  15-16
  2.4 实验方法与步骤  16-27
    2.4.1 DJ-1-shRNA 真核表达载体的构建  16-20
    2.4.2 重组质粒的转化及鉴定  20-21
    2.4.3 SGC7901 胃癌细胞的培养  21-22
    2.4.4 SGC7901 胃癌细胞的转染  22-23
    2.4.5 检测 SGC7901 胃癌细胞中 DJ-1mRNA 的含量  23-25
    2.4.6 Western blot 法检测 SGC7901 胃癌细胞 DJ-1 蛋白的表达  25-27
  2.5 数据处理  27-28
第3章结果  28-33
  3.1 重组质粒筛选与鉴定  28-30
    3.1.1 氨苄青霉素抗性筛选重组质粒  28-29
    3.1.2 重组质粒测序鉴定  29-30
  3.2 转染 siRNA 表达质粒对 SGC7901 胃癌细胞中 DJ-1 表达的影响  30-33
    3.2.1 对 SGC7901 胃癌细胞中 DJ-1mRNA 表达水平的影响  30-31
    3.2.2 对 SGC7901 胃癌细胞 DJ-1 蛋白表达水平的影响  31-33
第4章讨论  33-38
第5章结论与展望  38-39
  5.1 结论  38
  5.2 进一步的工作方向  38-39
致谢  39-40
参考文献  40-44
攻读学位期间的研究成果  44-45
综述  45-51
  参考文献  49-51

DJ-1-shRNA真核表达载体的构建及其对转染的SGC7901胃癌细胞DJ-1的影响

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