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基于表达谱芯片技术的食管癌转移相关基因筛选及功能鉴定

作　者: 汤善宏
导　师: 樊代明
学　校: 第四军医大学
专　业: 内科学
关键词: 食管癌表达谱芯片淋巴结转移 SDR9C7 MMP11
分类号: R735.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

【背景】食管癌是我国最为常见的消化道恶性肿瘤之一，尽管近年来在外科手术、内科放化疗及分子靶向治疗等方面取得一定的进步，但由于食管癌的高侵袭性，多数患者被确诊时已伴有局部侵袭、淋巴结和(或)远处转移，严重影响患者治疗效果及预后。由于食管癌转移机制仍不清楚,目前尚缺乏早期诊断手段及有效治疗的方法，是食管癌患者致死的主要原因之一。因此食管癌转移相关分子的筛选并食管癌转移分子机制的深入研究是解决其转移的早期诊断、治疗及预后判断的突破口。一些单个基因据报道在促进食管癌转移中起重要作用，然而食管癌的转移是一个涉及多因素、多基因、多信号转导通路参与的复杂的网络调控过程，单个基因研究难以反映其全貌。基因表达谱芯片技术因其高通量的特点成为研究基因表达的重要平台，本课题拟应用该技术筛选食管癌转移相关基因，并对重要的兴趣分子进行功能签定和机制分析，为全面理解食管癌转移的发生、发展提供理论依据，为食管癌转移诊治提供新的靶点。【目的】应用基因表达谱芯片技术筛选食管癌转移相关基因；研究其中差异最明显的基因之一SDR9C7（short chain dehydrogenase/reductase family9C, member7）在食管癌中表达的临床意义；明确SDR9C7调控食管癌侵袭和转移的作用与机制。【方法】1.选取3例手术时已发生淋巴结转移（高转移性）食管癌组织，与3例手术时未发生转移（低转移性）的食管癌组织，应用基因表达谱芯片筛选两组食管癌组织中差异性表达基因；2.应用免疫组化染色方法检测表达谱芯片筛选出的差异性最大的基因SDR9C7在食管癌组织中表达临床意义；3.应用transwell实验鉴定我科前期建立食管癌高转移潜能细胞亚系（EC109-P及EC9706-P），及低转移潜能细胞亚系（EC109-N及EC9706-N）外迁移及侵袭能力的差异；采用western blot检测SDR9C7在高低转移潜能细胞系中表达的差异；4.应用慢病毒携带的siRNA下调SDR9C7在其内源性高表达的高转移潜能食管癌细胞中表达水平，并应用MTT、平板克隆、裸鼠皮下成瘤、迁移、侵袭及裸鼠体内转移实验检测对食管癌细胞体内外生长、增殖、侵袭和转移能力的影响；5. Western blot检测转移相关蛋白在转染SDR9C7下调后细胞中表达变化；免疫组化染色SDR9C7与MMP11在食管癌组织表达的相关性，初步探讨其促进食管癌转移的作用机制。【结果】1.基因表达谱芯片结果发现，与低转性食管癌组织相比，26个转录子（对应23个基因）在高转移性组织表达水平显著增高，而32个转录子（对应30个基因）显著降低，其中SDR9C7的两个转录子在高转移食管癌中表达水平均高于低转移组织的7倍以上；2.免疫组化结果显示，SDR9C7主要着色于食管癌细胞浆，所有入选患者至随访终点时的总生存率为41.3%，中位生存时间为24月，平均随访时间为31.8月，SDR9C7表达为阳性患者生存率为29.9%(20/67)，阴性表达患者生存率为62.2%（23/37），Kaplan–Meier分析提示肿瘤分化程度(P=0.005)、淋巴结转移(P<0.001)、淋巴管侵润(P<0.001)、T分期(P<0.001)及SDR9C7表达水平(P=0.001)与患者术后生存时间密切相关。多因素回归分析提示患者肿瘤分化程度(P=0.02)、淋巴管侵润(P=0.03)及T分期(P=0.001)与患者预后密切相关，而SDR9C7(P=0.31)表达水平尚不能作为患者预后独立因素。3. Transwell实验证实，我科前期建立的食管癌高细胞系低EC109-P及EC9706-P侵袭及迁移能力显著强于其对应的低转移细胞系EC109-N与-N (P<0.001).；Westernblot检测发现SDR9C7在高转移细胞系表达水平明显强于其对应的低转移细胞系；4.经流式细胞术筛选绿色细胞后，荧光显微镜下观察发现，转染SDR9C7siRNA及对照病毒细胞绿色荧光携带率达95％以上。Western blot检测发现慢病毒携带的siRNA显著下调SDR9C7在食管癌高转移细胞系EC109-P及EC9706-P中表达水平。 MTT、平板克隆及裸鼠成瘤实验结果显示下调SDR9C7后对食管癌细胞体内、外生长与增殖能力无明显影响(P>0.05)。Transwell实验结果显示转染SDR9C7siRNA细胞的迁移及侵袭能力均显著低于转染对照病毒细胞；裸鼠尾静脉体内转移实验证实，下调SDR9C7后，食管癌高转移细胞EC9706-P在裸鼠肝肺等体内无明显转移灶形成，而注射对照细胞裸鼠肺脏出现大小不一的多个转移灶，病理切片及HE染色结果提示裸鼠肺脏转移灶个数及大小均显著高于对照细胞(P<0.01)。5. Western blot检测发现下调SDR9C7后，高转移细胞中MMP11表达水平明显下降，而E-cadherin、V-EGF表达水平无明显变化；SDR9C7与MMP11在食管癌组织中表达水平呈显著正相关(r=0.56， p＜0.001；Spearman’s rank test)。【结论】1.表达谱芯片筛选得到53个食管癌转移相关基因，其中有23个基因在高转移性组织表达上调，30个基因表达下降，SDR9C7表达差异最为显著（其两个转录子在高转移食管癌中表达水平均高于低转移组织的7倍以上）；2. SDR9C7表达水平与食管癌患者肿瘤转移和预后密切相关；3.食管癌高转移性细胞亚系EC109-P、EC9706-P的侵袭及迁移能力显著强于其对应低转移性细胞亚系EC109-N、EC9706-N，而增殖能力无明显差异；SDR9C7在高转移性细胞亚系EC109-P、EC9706-P的表达水平明显高于其对应低转移性细胞亚系EC109-N、EC9706-N；4.慢病毒携带的siRNA显著抑制SDR9C7在高转移性细胞亚系EC109-P、EC9706-P中表达水平；下调SDR9C7表达后食管癌细胞体内外侵袭和转移能力显著降低；5. SDR9C7至少部分通过调节MMP11表达水平来促进食管癌转移。

基于表达谱芯片技术的食管癌转移相关基因筛选及功能鉴定

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