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细胞内表达海洋来源的UPL1/AJL1/HdSABL基因抗肿瘤作用的机制研究

作　者: 杨新燕
导　师: 李恭楚
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 癌症凝集素 N-乙酰葡糖胺凝集素唾液酸凝集素半乳糖凝集素复制缺陷性腺病毒
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

癌症是威胁人类健康的主要疾病之一。与正常细胞相比，癌细胞内很多蛋白的糖基化发生改变。凝集素是一种糖类识别蛋白，可以特异性识别并结合特定的糖蛋白或糖脂，并通过糖类复合物调节细胞的生长、分化、信号传递、细胞迁移、凋亡、免疫调节等生物过程，已被应用于免疫学、肿瘤和细胞生物学等诸多方面的研究。之前，本课题组将掌叶半夏凝集素（Pinellia pedatisecta agglutinin，PPA）基因转入癌症细胞，发现PPA可与蛋白精氨酸甲基转移酶5(protein arginine methyltransferase5，PRMT5)结合，最终进入细胞核导致肿瘤细胞死亡。研究提示凝集素超家族中可能蕴藏抗癌基因。海洋凝集素种类繁多，可识别各种糖类，本文中选取海洋生物孔石莼(Uiva pertusa)N-乙酰葡糖胺凝集素UPL1、盘鲍鱼（Haliotis discus discus）唾液酸凝集素HdSABL以及日本鳗鱼(Anguilla japonica)半乳糖凝集素AJL1，将基因导入肿瘤细胞，在细胞水平上研究它们的毒性及机制。将AJL1、HdSABL、UPL1基因克隆到真核载体pEGFP-C1中，观察其蛋白在恶性肿瘤细胞内的亚细胞定位，并构建携带AJL1、HdSABL、UPL1基因的复制缺陷型腺病毒（AD-FLAG-AJL1，AD-FLAG-HdSABL及AD-FLAG-UPL）与对照病毒AD-FLAG，并在体外测定其对多种癌细胞的杀伤效果，探索其在细胞内的抑癌作用机理。本论文研究可为癌症基因治疗提供新的治疗基因。方法（1）构建pEGFP-GENE-C1系列真核表达载体；（2）荧光显微镜观察，筛选对癌细胞有毒性的凝集素；（3）激光共聚焦观察其在癌细胞的亚细胞定位；（4）利用Adeasy系统包装重组腺病毒AD-FLAG，AD-FLAG-AJL1，AD-FLAG-HdSABL及AD-FLAG-UPL；（5）MTT法检测病毒对多种癌细胞株生长的抑制作用；（6）细胞形态学观察几种腺病毒对几种癌细胞株的杀伤作用；（7）Annexin V/PI流式细胞术检测病毒诱导Hep3B细胞的凋亡；（8）Western blot方法检测细胞凋亡相关的信号分子。结果（1）成功构建pEGFP-GENE-C1系列真核表达载体，并使用Adeasy系统成功构建了携带凝集素AJL1、HdSABL、UPL1基因的腺病毒；（2）荧光显微镜观察其在癌细胞的表达，发现AJL1、HdSABL和UPL1三种凝集素都含有细胞毒性；（3）激光共聚焦实验观察在癌细胞内的亚细胞定位，表明AJL1的表达会使细胞收缩，UPL1、HdSABL表达前期呈散点状分布在细胞质及细胞器中，但最终都进入细胞核；（4）MTT、形态学观察实验证实AJL1、HdSABL、UPL1基因表达对癌细胞具有显著的杀伤作用；（5）Annexin V/PI流式细胞术实验得出AJL1和HdSABL可诱导Hep3B细胞发生凋亡，UPL1则不能；（6）Western blot结果发现HdSABL可通过下调凋亡抑制因子Bcl-2诱导细胞凋亡结论实验结果表明，在癌细胞内AJL1、HdSABL、UPL1蛋白的表达可以导致细胞死亡，其中，HdSABL可下调凋亡抑制因子Bcl-2引发细胞凋亡，AJL1也可诱导细胞凋亡。AJL1、HdSABL和UPL1有可能成为新的癌症治疗基因。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
缩略词  8-9
目录  9-11
1 引言  11-18
  1.1 癌症的研究概况及特征  11-13
    1.1.1 癌症的发生  11
    1.1.2 癌症的特征  11-12
    1.1.3 癌症的治疗方法—基因治疗  12-13
  1.2 凝集素  13-16
    1.2.1 凝集素的概况  13-14
    1.2.2 凝集素的研究现状  14
    1.2.3 N-乙酰葡糖胺凝集素的概况及研究现状  14-15
    1.2.4 唾液酸结合凝集素概况及研究现状  15
    1.2.5 半乳糖凝集素概况及研究现状  15-16
  1.3 论文研究基础  16-17
  1.4 实验方案设计  17-18
    1.4.1 实验的目的和意义  17
    1.4.2 研究内容  17-18
2 实验材料与方法  18-36
  2.1 实验材料  18-22
    2.1.1 主要质粒、菌株及细胞株  18
    2.1.2 生化试剂主要试剂配制  18-19
    2.1.3 主要试剂配制  19-20
    2.1.4 引物合成  20-21
    2.1.5 主要仪器  21-22
  2.2 实验方法  22-36
    2.2.1 分子实验部分  22-30
    2.2.2 细胞实验  30-32
    2.2.3 病毒实验部分  32-36
3 实验结果  36-57
  3.1 质粒鉴定  36-41
    3.1.1 重组质粒 pEGFP-AJL1-C1、pEGFP-HdSABL-C1  36-37
    3.1.2 重组质粒 pCA13-FLAG 、 pCA13-FLAG-UPL1 、 pCA13-FLAG-AJL1 、pCA13-FLAG-HdSABL 的鉴定  37-38
    3.1.3 重组质粒 pSHUTTLE-FLAG、pSHUTTLE-FLAG-AJL1、pSHUTTLE-FLAG-HdSABL、pSHUTTLE-FLAG-UPL1 的鉴定  38-39
    3.1.4 重组质粒 pAD-GENE 的鉴定  39-41
  3.2 病毒的包装、鉴定、扩增以及滴度测定  41-44
    3.2.1 AD-FLAG、AD-FLAG-AJL1、AD-FLAG-HdSABL、AD-FLAG-UPL1 腺病毒的鉴定  41-43
    3.2.2 腺病毒的扩增以及滴度测定  43-44
  3.3 几种凝集素的筛选  44-45
  3.4 凝集素细胞内的亚细胞定位  45-51
    3.4.1 AJL1 蛋白在细胞内的亚细胞定位  45-47
    3.4.2 HdSABL 蛋白在细胞内的亚细胞定位  47-49
    3.4.3 UPL1 蛋白在细胞内的亚细胞定位  49-51
  3.5 体外实验检测病毒对恶性肿瘤的杀伤效果  51-57
    3.5.1 MTT 法检测病毒对恶性肿瘤的杀伤能力  51-53
    3.5.2 细胞形态学观察  53-54
    3.5.3 Annexin V/PI 流式细胞术检测细胞凋亡  54-55
    3.5.4 Western blot 检测相关凋亡因子  55-57
4 讨论  57-59
5 结论  59-60
参考文献  60-65
致谢  65-66
硕士期间研究成果  66

细胞内表达海洋来源的UPL1/AJL1/HdSABL基因抗肿瘤作用的机制研究

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