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利用共生菌Lxc作为外源基因GNA的表达载体改良水稻抗虫性

作　者: 范雪莲
导　师: 曾汉来
学　校: 华中农业大学
专　业: 作物遗传育种学
关键词: 水稻内生菌 Leifsonia xyli subsp.Cynodontis 雪花莲外源凝集素基因GNA 氨基酸含量褐飞虱抗性
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

Leifsonia xyli subsp．cynodontis（Lxc，原名Clavibacter xyli subsp．cynodontis）是一种可广泛寄生于禾本科植物韧皮部维管束内的内共生细菌，于上世纪八十年代初首次从百慕大草（Cyhodon dactylon L．）中被分离、鉴定，研究发现它的共生寄主包括水稻、玉米、甘蔗、燕麦、草坪草等，对寄主植物不引发病症，可用植物浸出液培养或用特定引物从植物组织直接扩增出Lxc的DNA的方法来证明其内生。当前，通过转基因技术使植物获得外源基因表达特性是植物育种中有效的生物技术之一，但面临操作复杂和应用安全性等困难，一些研究者试图利用共生微生物作为外源基因表达体，在微生物平台上进行基因操作，在不改变植物遗传组成上获得目标基因功能，这将是一种新的转基因途径。雪花莲凝集素（Galanthus nivalis agglutinin，GNA）是来源于石蒜科雪花莲的植物凝集素，对蚜虫、飞虱、叶蝉等刺吸式害虫以及线虫有强烈的毒性，对鳞翅目等咀嚼式害虫具有中等毒性。本研究首先在Lxc接种水稻的方法、Lxc与水稻共生特性、共生对水稻生长发育和产量的影响方面进行了研究，然后构建了杀虫内生菌Lxc／GNA12-GUS并接种水稻，研究GNA通过Lxc在水稻中的表达，获得了一些有益的初步结果：1．苗期剪叶接种，Lxc能在水稻植株中共生。Lxc对水稻生长发育和产量不产生不良影响，且对绵恢725有促进抽穗、增加株高效应，对美国茉莉香粘有增产效应。2．Lxc菌液浸种处理，可达到接种目的。菌液浸种对发芽率、成苗率影响不明显，对绵恢725成苗率有促进效果。5.0OD₆₅₀的菌液浓度是有效的。3．PCR检测接种Lxc水稻植株，发现茎叶各部位均有Lxc共生，但成熟穗部和籽粒中无检测信号。接种Lxc-GUS用荧光检测能重复PCR检测结果，外源GUS基因能在水稻植株内表达。4．构建含雪花莲外源凝集素GNA基因的载体，载体转入Lxc，获得杀虫内生菌Lxc／GNA，接种水稻后在水稻组织内检测到GAN基因。5．Lxc／GNA接种水稻对水稻褐飞虱抗性、寄居数量进行初步鉴定，发现水稻的抗褐飞虱能力增强，植株上褐飞虱的寄居数量降低。6．接种Lxc／GNA水稻可溶性糖含量增加显著。美国茉莉香粘和绵恢725接种Lxc／GNA水稻的可溶性蛋白含量变化不明显，早籼D68的显著降低。利用酸水解法测定接种Lxc／GNA水稻三个供试品种苗期氨基酸含量变化，早籼D68品种茎秆和叶片中氨基酸总量均低于对照，达极显著水平；绵恢725品种茎杆和叶片中氨基酸总量均高于对照，差异不显著：美国茉莉香粘品种茎杆氨基酸总量高于对照，差异不显著，叶片氨基酸含量低于对照，差异达极显著水平。本研究认为，经过三年的水稻产量考察研究，Lxc作为外源基因载体来改良水稻某些特性基本可行，对Lxc／GNA接种水稻进行褐飞虱抗性鉴定表明抗褐飞虱能力增强，但抗性鉴定研究值得继续深入。本研究表明以Lxc为受体作为外源基因表达载体在植物体内表达，使植物获得目标基因相同或相近的功能而不必改变其遗传构成，可能是克服转基因粮食作物安全性和技术性问题的一种新途径。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
1 文献综述  11-25
  1.1 植物共生菌应用研究进展及应用前景  11-15
    1.1.1 植物内共生菌的定义  11
    1.1.2 植物共生菌与植物间的关系研究现状  11-12
      1.1.2.1 微生物与植物间的关系  11
      1.1.2.2 植物内生细菌和植物间的关系  11-12
    1.1.3 植物共生细菌应用研究进展  12-14
      1.1.3.1 植物生长促进细菌的研究  12-13
      1.1.3.2 PGPB促进植物生长的机制  13-14
    1.1.4 基因工程改造内共生菌研究进展  14-15
      1.1.4.1 应用植物内生菌作为植物遗传载体的优势  14-15
      1.1.4.2 植物内生菌表达外源基因的应用研究  15
  1.2 植物内共生菌Leifsonia xyli Subsp.cynodontis的研究现状  15-18
    1.2.1 Leifsonia xyli Subsp.cynodont&的发现  15-16
    1.2.2 Leifsonia xyli subsp.cynodont&和植物内生研究进展  16
    1.2.3 Leifsonia xyli subsp.cynodontis分子生物学研究和基因工程研究  16-18
    1.2.4 Leifsonia xyli subsp.cynodont&研究前景  18
  1.3 应用雪花莲外源凝集素基因抗虫研究进展  18-23
    1.3.1 GNA的构造  19
    1.3.2 GNA的抗虫机理  19-20
    1.3.3 含GNA的人工饲料对害虫的抗生作用  20-21
      1.3.3.1 GNA对一些害虫的拒食作用  20
      1.3.3.2 GNA可抑制害虫的生长发育,有直接毒杀作用  20-21
    1.3.4 转GNA植物研究现状  21
    1.3.5 重组GNA研究现状  21-22
    1.3.6 转GNA水稻研究现状  22-23
  1.4 本研究内容、目的和意义  23-25
2 材料与方法  25-34
  2.1 供试水稻材料  25
  2.2 质粒和引物  25
  2.3 菌株和培养基  25
  2.4 Lxc接种水稻方法  25-26
    2.4.1 浸种接种  25-26
    2.4.2 剪叶接种  26
  2.5 水稻水培实验  26
  2.6 水稻大田实验  26-27
  2.7 检测水稻中Lxc定殖  27-28
    2.7.1 PCR检测Lxc在水稻上定殖  27-28
      2.7.1.1 水稻DNA提取步骤  27
      2.7.1.2 PCR反应  27-28
    2.7.2 荧光法检测GUS基因在宿主植物水稻中的表达  28
      2.7.2.1 荧光法GUS提取缓冲液  28
      2.7.2.2 荧光法GUS分析缓冲液  28
      2.7.2.3 操作步骤  28
  2.8 抽穗期调查与农艺性状考种  28-29
  2.9 受体菌感受态制备与转化  29-30
    2.9.1 大肠杆菌感受态制备与转化  29-30
      2.9.1.1 转化溶液  29
      2.9.1.2 大肠杆菌受体菌的培养  29
      2.9.1.3 大肠杆菌感受态细胞的制备  29
      2.9.1.4 DNA转化  29-30
    2.9.2 Lxc菌感受态制备与转化  30
      2.9.2.1 Lxc菌感受态制备  30
      2.9.2.2 DNA转化  30
  2.10 提质粒  30-31
    2.10.1 碱法提质粒(大肠杆菌)  30-31
    2.10.2 STE法提质粒(Lxc)  31
  2.11 构建Lxc/GNA  31-32
    2.11.1 构建pET28a/GNA  31-32
    2.11.2 构建Lxc/GNA  32
  2.12 GNA基因在BL21中诱导表达  32
    2.12.1 转化获得BL21/GNA  32
    2.12.2 诱导表达  32
  2.13 水稻褐飞虱抗性鉴定  32
    2.13.1 飞虱寄居数量调查  32
    2.13.2 抗飞虱鉴定  32
  2.14 可溶性蛋白的测定  32-33
  2.15 可溶性糖的测定  33
  2.16 氨基酸的测定  33-34
3 结果和分析  34-53
  3.1 Lxc/GUS和水稻共生及其影响  34-43
    3.1.1 Lxc对水稻种子萌发及苗期的影响  34-36
      3.1.1.1 Lxc浸种对出芽率的影响  34
      3.1.1.2 浸种后水稻种子的成苗率  34-35
      3.1.1.3 株高比较  35-36
    3.1.2 水稻中Lxc的定殖检测  36-38
      3.1.2.1 PCR检测Lxc/GNA在水稻中的定殖  36-37
      3.1.2.2 以MUG作底物检测GUS在水稻上表达  37-38
    3.1.3 水稻抽穗调查  38-39
    3.1.4 Lxc对水稻产量性状的影响  39-43
  3.2 构建杀虫共生菌Lxc/GNA及水稻抗飞虱鉴定  43-47
    3.2.1 构建Lxc/GNA  43
    3.2.2 检测GNA在BL21上的诱导表达  43-44
    3.2.3 PCR检测Lxc/GNA在水稻中的定殖  44
    3.2.4 Lxc/GNA接种水稻后对水稻抗飞虱研究  44-47
      3.2.4.1 水稻接种后生长状况  44-45
      3.2.4.2 褐飞虱寄居数量变化  45-46
      3.2.4.3 接种水稻抗褐飞虱鉴定  46-47
  3.3 接种Lxc/GNA对水稻氨基酸含量的影响  47-53
    3.3.1 可溶性蛋白含量和可溶性糖含量变化  47-48
    3.3.2 氨基酸含量比较  48-53
      3.3.2.1 早籼D68氨基酸含量比较  48-49
      3.3.2.2 绵恢725氨基酸含量比较  49
      3.3.2.3 美国茉莉香粘氨基酸含量比较  49-53
4 结论与讨论  53-56
  4.1 Lxc可以和水稻植株共生,并且对某些品种有促生效应  53-54
  4.2 浸种接种方法简便易行  54
  4.3 外源基因可以通过Lxc共生在水稻体内表达  54
  4.4 GNA基因可以通过Lxc/GNA接种增加水稻抗虫性  54-55
  4.5 接种对水稻氨基酸含量产生变化  55-56
参考文献  56-64
致谢  64

利用共生菌Lxc作为外源基因GNA的表达载体改良水稻抗虫性

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