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H2S对大鼠缺血性神经损伤的保护作用及机制研究

作　者: 李战永
导　师: 张涛
学　校: 南开大学
专　业: 生物信息学
关键词: 硫化氢 脑缺血 空间认知 突触可塑性 神经振荡 血管新生
分类号: R745
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的通过在体实验观察外源性硫化氢（H2S）对大鼠海马CA1区锥体细胞和大鼠胶质瘤细胞在缺血损伤时的保护作用，并探讨相关机制。方法⑴40只雄性wistar大鼠随机分成4组：假手术组、缺血组、H2S组、缺血+H2S组，每组10只。采用双侧颈总动脉永久结扎（2VO）的方法建立慢性脑缺血大鼠模型；H2S组和缺血+H2S组大鼠给予腹腔注射NaHS（5.6mg/kg/day）处理。利用Morris水迷宫实验（MWM）观察比较各组大鼠空间学习、记忆能力；各组大鼠在MWM测试后分别断头取脑，测定海马内H2S含量；通过组织学方法（HE染色）观察各组大鼠海马CA1区锥体细胞的形态结构。⑵32只雄性wistar大鼠随机分为4组，每组8只，分组及处理方法同⑴。在体记录各组大鼠海马CA3、CA1区的局部场电位，用计算神经生物学方法分析大鼠海马CA3、CA1区神经网络的振荡模态（包括θ波段和γ波段）并进行比较；分别在体记录各组大鼠海马CA1区的长时程增强（LTP），并用免疫组织化学法观察各组大鼠海马CA1区生长相关蛋白（GAP-43）的表达情况。⑶40只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分成4组：假手术组，H2S组，肿瘤组，肿瘤+H2S组，每组10只。选用大鼠C6胶质瘤细胞系，通过纹状体内微量细胞注射的方法建立大鼠恶性胶质瘤（GBM）动物模型，H2S组和肿瘤+H2S组大鼠在脑内注射1周后给予腹腔注射NaHS（5.6mg/kg）1次；脑内注射3周后，各组大鼠分别断头取脑，肿瘤侧半脑用于制备冰冻切片，HE染色观察瘤内细胞形态，并计算瘤体体积；免疫组化染色观察瘤内血管内皮标记蛋白CD34、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和金属基质蛋白酶-2（MMP-2）的阳性表达情况，评估瘤体内微血管密度（MVD）；肿瘤对侧半脑用于脑内H2S含量测定。结果⑴慢性脑缺血大鼠海马内H2S含量显著降低（缺血组vs.假手术组，P＜0.05）；经外源性H2S处理后，慢性脑缺血大鼠海马内的H2S含量显著升高（缺血+H2S组vs.缺血组，P＜0.05），但仍低于假手术组（缺血+H2S组vs.假手术组，P＜0.05）。⑵MWM结果表明，与假手术组大鼠相比，缺血组大鼠的逃避潜伏期明显延长（P＜0.01），目标象限百分比显著减少（P＜0.001），穿越平台次数明显减少（P＜0.001）；经外源性H2S腹腔注射处理后，缺血+H2S组大鼠的逃避潜伏期（秒）明显缩短（定位巡航第5天，缺血组与缺血+H2S组相比为：15.91±2.51vs.8.09±1.50，P＜0.01），目标象限百分比（%）明显增加（缺血组与缺血+H2S组相比为：27.27±3.37vs.37.25±3.92，P＜0.05），穿越平台次数（次）显著增加（缺血组与缺血+H2S组相比为：1.83±0.27vs.3±0.46，P＜0.05）。四组大鼠的平均游泳速度无显著性差别（P＞0.05）。⑶假手术组和H2S组的CA1区锥体细胞形态正常。缺血组海马的CA1区锥体细胞出现明显的核固缩现象，胞浆染色不均，难以分辨正常的胞体形态，细胞周围可见明显水肿，细胞分布散乱不均；缺血+H2S组海马的CA1区锥体细胞也可见核固缩现象，但明显少于缺血组，细胞分布趋于均匀，胞周水肿也明显减少，胞浆染色也较均匀，可见多数锥体细胞的形态趋于正常。⑷对局部场电位的计算神经生物学分析结果表明，缺血会导致CA3与CA1之间的θ节律和γ节律相位同步性显著减弱，给予H2S后，两个脑区减弱的相位同步得到显著恢复。缺血导致CA3-CA1通路θ与γ节律上的信息流单方向指数c2的显著下降，而给予H2S后，这种下降趋势得到恢复。⑸与假手术组相比，缺血组的场兴奋性突触后电位（fEPSPs）斜率百分比显著降低（123.33±2.62vs.112.35±2.52，P＜0.001），在使用外源性H2S处理后，缺血+H2S组大鼠的fEPSPs斜率百分比得到明显提高（缺血+H2S组vs.缺血组：124.99±3.64vs.112.35±2.52，P＜0.001）。⑹GAP-43主要表达于锥体细胞的胞体及其附近，缺血组的GAP-43阳性表达最低，缺血+H2S组的GAP-43阳性表达介于假手术组和缺血组之间。缺血组与假手术组比较，P＜0.001；缺血组与缺血+H2S组比较，P＜0.001。⑺一次性给予低剂量NaHS（5.6mg/kg）可促进荷瘤鼠GBM瘤体的生长，表现为瘤体体积明显增大（P＜0.001），瘤体组织出现空洞，坏死、出血明显增多，新生血管明显增多。⑻肿瘤+H2S组与肿瘤组大鼠脑内H2S的含量均高于假手术组（P＜0.05），肿瘤+H2S组H2S含量比肿瘤组显著提高（P＜0.05）；肿瘤+H2S组大鼠脑内的CD34的阳性表达明显高于肿瘤组（P＜0.001）；肿瘤组和肿瘤+H2S组瘤内的MVD（条/mm2）测定结果分别为41.2±7.9和97.0±10.8,具有极显著性差异，P＜0.001；与肿瘤组相比，肿瘤+H2S组大鼠瘤体内HIF-1α和MMP-2的阳性表达量均显著增多（P＜0.001）。结论⑴外源性H2S可提高缺血大鼠模型海马内H2S的含量；⑵外源性H2S可改善慢性脑缺血大鼠的空间认知障碍，其机制与H2S可改善慢性脑缺血导致的大鼠海马锥体细胞的形态结构异常有关；⑶慢性脑缺血可造成海马内慢γ振荡与θ振荡模态的改变；外源性H2S可使慢性脑缺血导致的θ与γ模态改变得到一定程度的恢复，这有可能是H2S对抗慢性脑缺血认知损伤的一个新的机制；⑷H2S可增强慢性脑缺血时大鼠海马CA1区神经元LTP，这是H2S改善脑缺血导致的大鼠空间认知障碍的神经电生理机制，这种电生理作用与H2S促进脑缺血大鼠海马CA1区GAP-43的表达有关；⑸一次性给予低剂量（5.6mg/kg）的外源性H2S可促进GBM瘤体的血管新生，促进瘤体的生长，其机制与外源性H2S促进瘤体的HIF-1α和MMP-2表达有关；⑹H2S对缺血的海马锥体细胞和缺血的胶质瘤细胞都具有神经保护作用。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-11
目录  11-16
本文主要缩略语表  16-19
第一章 引言  19-29
  第一节 研究背景  19-26
    1.1.1 H_2S 在神经系统的功能研究进展  20-25
      1.1.1.1 气体信号分子  20-22
      1.1.1.2 内源性 H_2S 的生成、代谢及其调节  22-24
      1.1.1.3 H_2S 在神经系统的生理及病理生理作用  24-25
    1.1.2 脑缺血/缺氧对海马功能的影响  25
    1.1.3 H_2S 与脑缺血/缺氧  25-26
  第二节 研究目的、意义和内容  26-28
    1.2.1 研究目的  26-27
    1.2.2 研究意义  27
    1.2.3 主要内容与方法  27-28
  第三节 本论文的结构安排  28-29
第二章 H_2S 对慢性脑缺血大鼠空间认知功能的影响  29-55
  第一节 前言  29-35
    2.1.1 海马与学习记忆功能  29-31
    2.1.2 脑缺血对海马功能的影响  31-33
    2.1.3 H_2S 改善脑缺血后功能  33-35
  第二节 材料与方法  35-43
    2.2.1 实验材料  35-38
      2.2.1.1 实验动物  35
      2.2.1.2 主要实验试剂  35-36
      2.2.1.3 主要试剂配方  36-37
      2.2.1.4 主要实验仪器  37
      2.2.1.5 计算机软件  37-38
    2.2.2 实验方法  38-43
      2.2.2.1 动物分组及处理  38
      2.2.2.2 大鼠慢性脑缺血模型（2VO）制备  38-39
      2.2.2.3 MWM 测试及数据处理  39-41
      2.2.2.4 大鼠灌流取脑  41
      2.2.2.5 大鼠脑冰冻切片制备  41-42
      2.2.2.6 脑片 HE 染色及结果判断  42
      2.2.2.7 海马 H_2S 含量测定  42-43
      2.2.2.8 数据处理及统计分析  43
  第三节 结果  43-49
    2.3.1 实验大鼠情况  43
    2.3.2 H_2S 对慢性脑缺血大鼠的空间认知障碍的影响  43-49
      2.3.2.1 MWM 定位巡航训练结果  44-46
      2.3.2.2 MWM 空间探索测试结果  46-48
      2.3.2.3 大鼠海马 CA1 区细胞形态学改变  48
      2.3.2.4 大鼠海马内 H_2S 含量变化  48-49
  第四节 讨论  49-54
    2.4.1 实验中的动物分组及给药依据  49-50
    2.4.2 外源性 H_2S 对慢性脑缺血大鼠空间认知的影响  50-52
    2.4.3 慢性脑缺血对大鼠海马内 H_2S 含量的影响及其机制  52-53
    2.4.4 外源性 H_2S 的神经保护作用与其应用浓度有关  53-54
  第五节 小结  54-55
第三章 H_2S 对慢性脑缺血大鼠海马电生理功能的影响  55-82
  第一节 前言  55-63
    3.1.1 海马的结构及功能  55-56
    3.1.2 海马锥体细胞的突触可塑性  56-58
    3.1.3 海马的神经振荡  58-61
    3.1.4 神经振荡与学习记忆功能  61
    3.1.5 脑缺血对海马神经元活动的影响  61-62
    3.1.6 H_2S 与神经振荡  62-63
  第二节 材料与方法  63-70
    3.2.1 实验材料  63-66
      3.2.1.1 实验动物  63
      3.2.1.2 主要实验试剂  63-64
      3.2.1.3 主要试剂配方  64-65
      3.2.1.4 主要实验仪器  65
      3.2.1.5 计算机软件  65-66
    3.2.2 实验方法  66-70
      3.2.2.1 动物分组及处理  66
      3.2.2.2 大鼠慢性脑缺血模型（2VO）制备  66
      3.2.2.3 海马 CA3-CA1 电生理记录  66-68
      3.2.2.4 大鼠灌流取脑  68
      3.2.2.5 大鼠脑冰冻切片制备  68
      3.2.2.6 免疫组化染色及结果判断  68-69
      3.2.2.7 海马内电极定位观察  69
      3.2.2.8 LTP 数据分析  69-70
      3.2.2.9 LFPs 数据分析指标及参数  70
      3.2.2.10 PLV 计算  70
      3.2.2.11 NIF 计算  70
      3.2.2.12 数据处理及统计分析  70
  第三节 结果  70-76
    3.3.1 H_2S 对慢性脑缺血大鼠海马 CA1 区神经元突触可塑性的影响  70-74
      3.3.1.1 电极定位  70-71
      3.3.1.2 海马 CA1 区神经元突触可塑性的变化  71-74
    3.3.2 海马 CA1 区生长相关蛋白（GAP-43）的表达  74-75
    3.3.3 PLV 结果  75
    3.3.4 NIF 结果  75-76
  第四节 讨论  76-80
    3.4.1 H_2S 对慢性脑缺血大鼠海马 CA1 区神经元突触可塑性的影响  76-78
    3.4.2 H_2S 影响脑缺血后的神经振荡  78-80
  第五节 小结  80-82
第四章 H_2S 促进大鼠恶性胶质瘤的血管新生  82-102
  第一节 前言  82-85
    4.1.1 血管新生与肿瘤  82-83
    4.1.2 神经胶质瘤及其动物模型  83
    4.1.3 H_2S 与血管新生  83-85
  第二节 材料与方法  85-90
    4.2.1 实验材料  85-87
      4.2.1.1 实验动物  85
      4.2.1.2 实验用细胞系  85
      4.2.1.3 主要实验试剂  85-86
      4.2.1.4 主要实验液体配方  86
      4.2.1.5 主要实验仪器  86-87
      4.2.1.6 计算机软件  87
    4.2.2 实验方法  87-90
      4.2.2.1 细胞培养  87
      4.2.2.2 动物分组及处理  87-88
      4.2.2.3 C6 胶质瘤大鼠模型制备  88
      4.2.2.4 大鼠灌流取脑  88
      4.2.2.5 大鼠脑冰冻切片制备  88
      4.2.2.6 脑片 HE 染色及结果判断  88
      4.2.2.7 肿瘤体积的测定  88-89
      4.2.2.8 免疫组化染色及结果判断  89
      4.2.2.9 肿瘤微血管密度的测定  89
      4.2.2.10 脑组织 H_2S 含量测定  89-90
      4.2.2.11 数据处理及统计分析  90
  第三节 结果  90-97
    4.3.1 荷瘤鼠一般表现  90
    4.3.2 大鼠脑内 H_2S 的含量  90-91
      4.3.2.1 H_2S 标准曲线  90
      4.3.2.2 脑内 H_2S 含量  90-91
    4.3.3 HE 染色结果  91-92
    4.3.4 脑内胶质瘤体积测定  92-93
    4.3.5 免疫组化阴性对照结果  93-94
    4.3.6 CD34 表达及瘤内微血管密度测定  94-95
      4.3.6.1 CD34 的表达  94-95
      4.3.6.2 MVD 测定结果  95
    4.3.7 HIF-1α的表达  95-96
    4.3.8 MMP-2 的表达  96-97
  第四节 讨论  97-101
    4.4.1 选择 GBM 作为研究对象的原因以及 NaHS 的给药依据  97-98
    4.4.2 外源性 H_2S 促进脑内 GBM 的生长  98
    4.4.3 脑内 H_2S 含量与 GBM 的发育侵袭有关  98-100
    4.4.4 H_2S 促进 GBM 的血管新生  100
    4.4.5 H_2S 促进 GBM 内 HIF-1α的表达  100
    4.4.6 H_2S 促进 GBM 内 MMP-2 的表达  100-101
  第五节 小结  101-102
第五章 结论与展望  102-105
  第一节 主要结论  102-103
  第二节 主要创新点  103-104
  第三节 研究前景展望  104-105
参考文献  105-122
致谢  122-123
附录  123-154
  气体信号分子 H_2S 的神经保护作用研究进展  123-139
    参考文献  135-139
  海马结构γ振荡的研究进展  139-154
    参考文献  149-154
个人简历  154-155
在学期间发表论文  155-156

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 周围神经及神经节疾病
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