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Slo3通道对小鼠精子Ca²⁺信号作用的研究

作　者: 贺瑞君
导　师: 李葆明
学　校:
专　业: 生理学
关键词: 男性不育 Slo3通道 KSper Ca2+信号荧光共聚焦奎尼丁过氧化氢
分类号: R698.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景和目的：不育不孕症是影响人类繁衍和心理健康的一种重要临床疾病,其中约有一半的病因在于男性。精子是男性生育最重要的因素之一,由睾丸生成,它逐渐成熟后贮存在附睾内,但此时的精子是不具有授精能力。精子进入雌性生殖道后,随着理化环境(pH值、渗透压和化学成份等)的改变,会经历获能、超活化和顶体反应等生理过程,最终完成授精。这些生理过程是精子功能必不可少的部分,对精子完成授精至关重要。与在其它细胞相似,Ca2+作为精子细胞的第二信使扮演着重要的角色,其直接或者间接调控精子获能、超活化和顶体反应等重要生理过程。Ca2+通过精子细胞膜上的Ca2+通道流入细胞中。目前利用电生理技术在小鼠精子上检测到电流只有两种,一是由CatSper通道介导的Ca2+电流；另一是由Slo3通道介导的K+电流。已经有研究表明小鼠精子上最主要的K+离子通道——Slo3在精子的获能过程中具有重要作用。随着精子胞内碱化,精子膜上的pH依赖的Slo3通道随之开放,导致细胞膜电位超极化。膜电位超极化可能通过两方面影响精子ca2+信号：一方面增加Ca2+内流的驱动力使Ca2+内流增多；另一方面降低电压依赖的CatSper通道开放概率而减少Ca2+内流。尽管推断Slo3通道是精子Ca2+信号的重要调节,但其单独对的Ca2+信号作用尚不明确。在诸多的Slol通道特异的以及广泛的K+通道阻断剂中,如CTX、IbTX、TEA、4-AP以及奎尼丁等,只有奎尼丁能强效抑制Slo3通道。另外活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)对小鼠精子功能也具有影响作用。虽然适量的ROS与精子正常生理功能密切相关,但是ROS过量时会引起细胞氧化-抗氧化失衡,对精子造成严重的损伤,降低精子活性、抑制顶体反应、严重影响精子的授精能力。ROS对精子造成的损伤与Slo3-/-精子的表型非常相似,另外已知ROS对Slo1通道有抑制作用,而Slo3与Slol在结构上非常相似,基于这些相似性我们推断ROS可能通过作用于Slo3通道而对精子胞内Ca2+信号有影响作用。通过本课题的研究希望探索到男性不育与Slo3通道的相关病因,以及为开发新型、安全、有效的男性避孕药提供理论依据。方法：一、利用荧光共聚焦Ca2+成像技术,对三个月以上的雄鼠精子处理后进行实验；对细胞进行以下处理：空白对照组(Ctrl)、奎尼丁处理组(Ctrl+Qui)、过氧化氢(H202)处理组,随机选取三个月以上的雄性小鼠。实验内容：1、取小鼠附睾尾部分装在离心管中离心；2、将离心后的精子分置在已经涂有Cell-Tak和Poly-L-lysine hydrobromide等试剂的容器中,并使细胞充分贴壁；3、在精子充分贴壁的容器中加入Fluo-4AM染料,在保证室温、避光等实验条件下使细胞染色30分钟；4、将黏贴有精子的容器充分清洗后,在60倍油镜下观察精子给药后的荧光变化,激发光波长488nm,接收波长535-565nm。二、利用膜片钳技术：在全细胞模式下充分研究奎尼丁对KSper的抑制,预期找到奎尼丁阻断精子本身K+电流的剂量-效应关系。结果：1、奎尼丁会使精子细胞Ca2+信号降低,并且这种降低作用与奎尼丁浓度呈正相关,即随着奎尼丁浓度的增加,其对精子Ca2+信号的抑制作用也增加。奎尼丁实验浓度分别为0.1μM、1pM,10μM、100μM和1000μM,加药后观察到精子细胞Ca2+信号都下降,0.1μM浓度的奎尼丁可以引起精子内Ca2+信号降低约16%；1μM浓度的奎尼丁可以引起精子内Ca2+信号发生大约28%的下降；10μM浓度的奎尼丁就可以引起精子内Ca2+信号发生更大的变化,大约降低45%；而100μM及1000μM浓度的奎尼丁引起精子细胞Ca2+信号降低的幅度更大,分别约73%和90%。信号下降一般的药物浓度(IC50)大约是11μM。有趣的是奎尼丁抑制KSper的IC50大约是10μM。2、我们初步的数据表明H202也影响精子Ca2+信号。但与奎尼丁不同的是,过氧化氢在低浓度时表现出对精子Ca2+信号的促进作用；在高浓度时则表现出较大的抑制作用。过氧化氢实验浓度分别为100μM、1000μM、1×106μM,100μM浓度的H202使精子细胞Ca2+信号增加约30%,而1000μM和1×106μM浓度的H202则使精子细胞Ca2+信号分别下降60%和90%左右。H202对精子Ca2+信号的影响是否与Slo3通道相关还需要更深入的研究。结论：当Slo3通道被奎尼丁抑制时精子细胞内Ca2+浓度降低,提示受碱性激活Slo3通道开放时其净作用将增加细胞Ca2+的内流。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-8
目录  8-11
第1章引言  11-33
  1.1 概述  11-12
  1.2 精子的结构  12-14
    1.2.1 头部  12-13
    1.2.2 尾部  13-14
  1.3 精子的发生和成熟  14-17
    1.3.1 精子发生  15-16
    1.3.2 精子成熟  16-17
  1.4 精子获能  17-18
    1.4.1 获能概念  17
    1.4.2 获能过程  17
    1.4.3 获能过程中精子发生的变化  17-18
  1.5. 精子超活化运动  18-19
    1.5.1 精子获能后运动方式明显改变  18
    1.5.2 精子运动的检测方法  18-19
  1.6 精子授精功能  19-20
    1.6.1 精卵识别  19
    1.6.2 顶体反应  19-20
  1.7 Ca~(2+)对精子功能的作用  20-23
    1.7.1 Ca~(2+)在精子成熟过程中的作用  20-21
    1.7.2 Ca~(2+)对精子运动的作用  21
    1.7.3 Ca~(2+)与精子获能  21-22
    1.7.4 Ca~(2+)在顶体反应中的作用  22
    1.7.5 精子胞内Ca~(2+)两大来源  22
    1.7.6 精液中的Ca~(2+)测定  22-23
  1.8 精子上主要的离子通道  23-30
    1.8.1 Ca~(2+)通道  23-27
    1.8.2 K~+通道  27-28
    1.8.3 HV1通道  28
    1.8.4 离子通道与精子的生理功能  28-30
  1.9 Slo3与精子细胞Ca~(2+)信号  30-32
    1.9.1 Slo3与Ksper  30
    1.9.2 Slo3与精子细胞Ca~(2+)信号  30-31
    1.9.3 奎尼丁是Slo3通道的强效阻断剂  31-32
    1.9.4 H_2O_2可能影响精子功能  32
  1.10 研究的目的和意义  32-33
第2章材料与方法  33-40
  2.1 材料  33-37
    2.1.1 实验动物  33
    2.1.2 主要试剂  33-34
    2.1.3 主要仪器  34-37
  2.2 方法  37-40
    2.2.1 溶液配制  37
    2.2.2 细胞处理  37-38
    2.2.3 药物浓度  38
    2.2.4 膜片钳检测奎尼丁对KSper的影响  38
    2.2.5 荧光共聚焦单细胞Ca~(2+)测定  38
    2.2.6 数据表达  38-39
    2.2.7 数据分析  39-40
第3章结果  40-56
  3.1 膜片钳检测奎尼丁(Quinidine)对精子KSper的作用  40-42
  3.2 不同浓度的奎尼丁(Quinidine)对精子Ca~(2+)信号的影响  42-50
    3.2.1 8-Br-cAMP对精子Ca~(2+)信号的影响  42
    3.2.2 0.1μM浓度的奎尼丁使精子Ca~(2+)信号平均降低16%  42-44
    3.2.3 1μM浓度的奎尼丁使精子Ca~(2+)信号平均降低28%  44-45
    3.2.4 10μM浓度的奎尼丁使精子Ca~(2+)信号平均降低45%  45-46
    3.2.5 100μM浓度的奎尼丁使精子Ca~(2+)信号平均降低73%  46-48
    3.2.6 1000μM浓度的奎尼丁使精子内Ca~(2+)信号平均降低90%  48-49
    3.2.7 奎尼丁未抑制Ca~(2+)信号的拟合曲线  49-50
  3.3 不同浓度的过氧化氢（H_2O_2)对精子C~(2+a)信号的影响  50-56
    3.3.1 100μM浓度的H_2O_2对精子细胞Ca~(2+)信号的影响  50-51
    3.3.2 1000μM浓度的H_2O_2对精子细胞Ca~(2+)信号的影响  51-53
    3.3.3 1×10~6μM浓度的H_2O_2对精子细胞Ca~(2+)信号的影响  53-55
    3.3.4 不同浓度的H_2O_2对精子细胞Ca~(2+)信号影响的比较  55-56
第4章讨论  56-59
  4.1 奎尼丁对精子细胞Ca~(2+)信号的影响  56-57
  4.2 过氧化氢对精子细胞Ca~(2+)信号的影响  57-59
第5章结论  59-60
致谢  60-61
参考文献  61-68
综述  68-76
  参考文献  74-76

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