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核仁素反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞MG-63抑制作用的实验研究

作　者: 崔俊成
导　师: 王万春
学　校: 中南大学
专　业: 外科学
关键词: 核仁素骨肉瘤反义寡核苷酸裸鼠动物模型
分类号: R738.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

第一部核仁素反义寡核苷酸的合成及功能鉴定目的：合成核仁素随机、正义和反义寡核苷酸序列,为研究核仁素反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞MG-63增殖的抑制作用做准备。方法：(1)采用全硫代修饰合成核仁素随机、正义和反义寡核苷酸序列,利用阳离子脂质体将其包裹后转染进入体外培养的人骨肉瘤细胞MG-63中；(2)通过荧光显微镜观察寡核苷酸是否有效转染进入人骨肉瘤细胞MG-63内；(3) RT-PCR、Western Bloting检测转染核仁素反义寡核苷酸后人骨肉瘤细胞MG-63中核仁素mRNA及蛋白表达的变化。结果：(1)荧光显微镜下观察,可见约65%的细胞染上绿色荧光；(2) RT-PCR及Western Bloting检测转染核仁素反义寡核苷酸后人骨肉瘤细胞MG-63中核仁素mRNA及蛋白表达,结果显示：核仁素反义寡核苷酸抑制了人骨肉瘤细胞MG-63中核仁素mRNA和蛋白的表达,可使其表达水平下调。结论：(1)成功构建核仁素反义寡核苷酸；(2)有效地将核仁素反义寡核苷酸转染进入人骨肉瘤细胞MG-63中。第二部分核仁素反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞MG-63增殖抑制及诱导凋亡的实验研究目的：探讨核仁素反义寡核苷酸在抑制人骨肉瘤细胞MG-63增殖以及体外下调核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表达与诱导细胞凋亡的作用。方法：(1)将人骨肉瘤细胞MG-63随机分为四组：对照组、转染随机寡核苷酸组、转染正义寡核苷酸组与转染反义寡核苷酸组;(2)采用阳离子脂质体介导的寡核苷酸技术将核仁素随机、正义和反义寡核苷酸转染进入人骨肉瘤细胞MG-63中；(3)用MTT法检测各组MG-63细胞的增殖率,并用Western Bloting和RT-PCR检测各组MG-63细胞中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表达情况；(4)用流式细胞术检测各组MG-63细胞的凋亡率。结果：(1)MTT检测各组MG-63细胞增殖率显示：核仁素反义寡核苷酸著抑制了人骨肉瘤细胞MG-63的增殖,与对照组、转染随机寡核苷酸组、转染正义寡核苷酸组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)；(2) Western Bloting和RT-PCR检测各组MG-63细胞中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表达情况,结果显示：转染反义寡核苷酸组与对照组、转染随机寡核苷酸组、转染正义寡核苷酸组相比较,核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05)；转染随机寡核苷酸组、转染正义寡核苷酸组与对照组相比较,核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表达无明显影响,差异无统计学意义(p>0.05)；(3)流式细胞术检测各组细胞的凋亡率,结果显示转染反义寡核苷酸组与对照组、转染随机寡核苷酸组、转染正义寡核苷酸组相比较,细胞凋亡率增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：(1)核仁素反义寡核苷酸能抑制人骨肉瘤细胞MG-63增殖；(2)核仁素反义寡核苷酸能诱导入骨肉瘤细胞MG-63凋亡。第三部分核仁素反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞裸鼠移植瘤的抑制作用目的：探讨核仁素反义寡核苷酸在抑制人骨肉瘤细胞裸鼠移植瘤的生长以及在体内下调核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表达与诱导细胞凋亡的作用。方法：(1)将人骨肉瘤细胞MG-63悬液的细胞浓度调整为1x108/ml,每只裸鼠右前腿背侧皮下注射0.2m1细胞悬液(细胞数为2x107/只),建立人骨肉瘤细胞裸鼠移植瘤动物模型；(2)将构建成功的动物模型随机分为4组：对照组、随机寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、反义寡核苷酸组；(3)采用瘤旁注射的方式,随机寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、反义寡核苷酸组分别于瘤旁注射2mg/kg体重的随机、正义及反义寡核苷酸；对照组瘤旁注射等量生理盐水,每日1次,共15次,观察裸鼠及移植瘤的生长状态；(4)每3天以游标卡尺测量肿瘤1次,HE染色观察移植瘤组织学形态,免疫组化检测各组荷瘤鼠移植瘤组织中核仁素及Bcl-2的表达情况,Western Bloting和RT-PCR检测各组荷瘤鼠移植瘤组织中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表达变化情况,流式细胞术检测各组荷瘤鼠移植瘤组织细胞凋亡率。结果：(1)以人骨肉瘤细胞株MG-63成功构建人骨肉瘤细胞裸鼠移植瘤动物模型；(2)反义寡核苷酸组与对照组、随机寡核苷酸组、正义寡核苷酸组相比较,反义寡核苷酸组移植瘤体积明显小于对照组、随机寡核苷酸组及正义寡核苷酸组,差异有统计学意义(P<0.05)；(3)免疫组化检测各组荷瘤鼠移植瘤组织中核仁素及Bcl-2的表达情况,结果显示核仁素反义寡核苷酸在裸鼠体内能够抑制移植瘤组织中核仁素、Bcl-2的表达,与对照组、随机寡核苷酸组及正义寡核苷酸组相比较,差异有统计学意义(P<0.05),随机寡核苷酸组、正义寡核苷酸组与对照组相比较,移植瘤组织中核仁素、Bcl-2的表达无明显影响,差异无统计学意义(p>0.05)；(4) Western Bloting和RT-PCR检测各组荷瘤鼠移植瘤组织中核仁素、Bcl-2蛋白和]mRNA的表达变化情况,结果显示核仁素反义寡核苷酸在裸鼠体内能够抑制移植瘤组织中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表达,与对照组、随机寡核苷酸组及正义寡核苷酸组相比较,差异有统计学意义(P<0.05),随机寡核苷酸组、正义寡核苷酸组与对照组相比较,移植瘤组织中核仁素、Bcl-2蛋白和mRNA的表达无明显影响,差异无统计学意义(p>0.05)；(5)流式细胞术检测各组荷瘤鼠移植瘤组织细胞凋亡率,结果显示反义寡核苷酸组移植瘤组织细胞凋亡率明显高于对照组、随机寡核苷酸组及正义寡核苷酸组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：(1)核仁素反义寡核苷酸在体内能够抑制人骨肉瘤细胞裸鼠移植瘤的生长；(2)核仁素反义寡核苷酸在体内能够下调移植瘤组织内核仁素的表达。

全文目录

摘要  4-8
ABSTRACT  8-15
英文缩写词表  15-17
前言  17-19
第一部分核仁素反义寡核苷酸的合成及功能鉴定  19-39
  1.1 引言  19
  1.2 材料与方法  19-32
    1.2.1 人骨肉瘤细胞株来源  19
    1.2.2 主要试剂  19-20
    1.2.3 主要仪器及设备  20-21
    1.2.4 主要试剂的配制  21-24
    1.2.5 实验方法  24-32
    1.2.6 统计学处理  32
  1.3 实验结果  32-36
  1.4 讨论与分析  36-38
  1.5 结论  38-39
第二部分核仁素反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞MG-63增殖抑制及诱导凋亡的实验研究  39-54
  2.1 引言  39
  2.2 材料和方法  39-44
    2.2.1 人骨肉瘤细胞株来源  39-40
    2.2.2 主要试剂  40
    2.2.3 主要仪器及设备  40-41
    2.2.4 主要试剂的配制  41
    2.2.5 实验方法  41-44
    2.2.6 统计学处理  44
  2.3 实验结果  44-51
  2.4 讨论与分析  51-53
  2.5 结论  53-54
第三部分核仁素反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞裸鼠移植瘤的抑制作用  54-75
  3.1 引言  54
  3.2 材料与方法  54-61
    3.2.1 人骨肉瘤细胞株来源  54
    3.2.2. 实验动物来源  54-55
    3.2.3 主要试剂  55
    3.2.4 主要仪器设备  55-57
    3.2.5 主要试剂的配制  57
    3.2.6 实验方法  57-61
  3.3 实验结果  61-72
  3.4 讨论与分析  72-74
  3.5 结论  74-75
参考文献  75-82
综述  82-98
  参考文献  93-98
致谢  98-99
攻读学位期间主要成果和获奖情况  99

核仁素反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞MG-63抑制作用的实验研究

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