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miRNA干扰FASN表达对骨肉瘤细胞生物学行为影响的体外研究

作　者: 毛建华
导　师: 黄山虎
学　校:
专　业: 外科学
关键词: 脂肪酸合成酶 RNAi干扰 骨肉瘤 侵袭 迁移
分类号: R738.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：构建和筛选沉默FASN基因的最佳重组质粒，探讨下调FASN基因表达对人骨肉瘤细胞U2-OS细胞体外增殖、侵袭、迁移能力的影响。方法：①根据NCBI查询到的FASN cDNA序列设计并合成靶向FASN的寡聚核苷酸序列，连接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体中构建重组质粒（分别命名为X197-1、2、3、4）。重组质粒与脂质体2000共转染人骨肉瘤U2-OS细胞后，在倒置荧光显微镜下观察荧光率。RT-PCR和Western blot检测构建的重组质粒对FASN的mRNA及蛋白表达的影响。②优化的质粒转染条件，以优化转染条件（(plasmid: Lipofectamine2000=1:3)）转染人骨肉瘤细胞U2-OS，MTT法检测细胞增殖变化，划痕愈合和Transwell侵袭实验检测细胞侵袭、迁徙能力。结果：①成功构建质粒，其中质粒(X197-1、X197-2)转染U2-OS骨肉瘤细胞的荧光率大于50%。四质粒均能有效抑制FASN mRNA(53.2±4%、47.5±3%、41.9±5%、52.8±2)%及FASN蛋白的表达（抑制率：79.4%、47.3%、64.5%、64.2%）。同其他质粒相比，X197-1被筛为最佳质粒。②MTT法检测转染X197-1质粒的细胞在24h、48h、72h、96h的OD值分别为（0.1183±0.0408、0.1567±0.0476、0.3033±0.0121、0.4783±0.0107），明显低于阴性对照组和空白组(p＜0.05)。划痕愈合实验结果示转染X197-1质粒的细胞迁移率(13.7±8.7%)明显低于阴性对照组(74.8±4.5%)和空白组(77.6±6.4%)(p＜0.05)。Transwell侵实验结果显示转染X197-1质粒的细胞穿膜数(55±4.8)个明显少于少于阴性对照质粒组(135±7.4)个和空白组(146±6.7)个(p＜0.05)。这些数据表明构建的干扰质粒沉默FASN基因能显著的降低骨肉瘤细胞U2-OS的增殖、迁移和侵袭能力。结论：靶向FASN基因的重组干扰质粒构建成功。沉默FASN表达后能有效抑制人骨肉瘤细胞系U2-OS细胞的增殖、侵袭和迁移，为下一步实验打下坚实的基础。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
中英文缩略词表  9-10
第1章 前言  10-14
第2章 材料与方法  14-29
  2.1 实验材料、试剂及仪器  14-15
    2.1.1 细胞  14
    2.1.2 菌种  14
    2.1.3 质粒载体  14
    2.1.4 主要试剂  14-15
  2.2 实验软件及仪器  15-16
    2.2.1 常用实验软件  15
    2.2.2 主要实验仪器及设备  15-16
  2.3 主要试剂的配制  16-19
    2.3.1 细胞培养相关试剂配制  16-17
    2.3.2 PCR 实验相关试剂配制  17-18
    2.3.3 Western Blot 实验主要试剂配制  18-19
    2.3.4 大肠杆菌培养相关试剂配制  19
  2.4 实验方法  19-29
    2.4.1 实验分组  19-20
    2.4.2 重组质粒的构建  20-21
    2.4.3 RNAi 沉默 FASN 对骨肉瘤 U2-OS 细胞增殖、侵袭和转移的影响  21-28
    2.4.4 统计处理  28-29
第3章 结果  29-39
  3.1 靶向 FASN 的重组质粒构建  29
  3.2 靶向 FASN 的重组质粒测序结果  29-30
  3.3 质粒电泳图  30-31
  3.4 重组质粒转染 U2-OS 细胞前、后形态变化  31
  3.5 优化质粒转染条件  31-32
  3.6 最佳质粒的筛选  32-33
  3.7 抑制 FASN 表达对 FASN mRNA 表达的影响  33-35
    3.7.1 RNA 的纯度及浓度测定  33-34
    3.7.2 干扰质粒转染后抑制了 FASN mRNA 的表达  34-35
  3.8 质粒转染后 U2-OS 细胞 FASN 蛋白的表达  35
  3.9 沉默 FASN 抑制了骨肉瘤 U2-OS 细胞的增殖  35-36
  3.10 沉默 FASN 后抑制了骨肉瘤 U2-OS 细胞迁徙  36-37
  3.11 沉默 FASN 后抑制了骨肉瘤 U2-OS 细胞侵袭  37-39
第4章 讨论  39-43
第5章 结论与展望  43-44
致谢  44-45
参考文献  45-48
攻读学位期间的研究成果  48-49
综述  49-54
  参考文献  53-54

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 运动系肿瘤 > 骨骼肿瘤
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