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ATF4调节骨血管生成的作用和机制的研究

作　者: 朱珂
导　师: 肖国芝
学　校: 南开大学
专　业: 动物学
关键词: 血管生成 ATF4 成骨细胞缺氧 HIF-1α VEGF 破骨细胞
分类号: R68
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

骨是密布血管的组织。越来越多的证据表明,在骨骼发育及骨受到损伤的再生过程中,血管生成对于骨的形成和修复至关重要。但是,调控骨中血管生成的机制并不完全清楚。转录激活因子4(ATF4)对于机体生命过程中的骨骼发育是必需的,但是ATF4在骨血管生成中的作用却不明确。在本文中,我们运用对比增强型灌注成像技术研究了野生型和Aft4敲除小鼠头盖骨和股骨中的血管生成情况,发现Aft4敲除的小鼠头盖骨和股骨中血管容积和数量显著降低。对小鼠的胫骨切片进行CD31的免疫组织化学染色,发现Aft4敲除的胫骨骨骺部位的外膜和骨干部位的内膜中CD31的阳性面积明显减少,表明血管面积和密度降低。Real-TimePCR结果显示,Aft4敲除的小鼠胫骨中Vegf及其三个异构体Vegf120, Vegf165和Vegf188的mRNA显著下降。免疫组织化学实验表明,Aft4敲除的小鼠中VEGF在骨小梁表面的成骨细胞中以及在骨质中的表达降低。但是,野生型和Aft4敲除小鼠的血清中VEGF的含量并没有变化。体外血管形成实验表明,Aft4敲除的跖骨中内皮细胞从跖骨的长出几近丧失,但当添加重组的VEGF蛋白时,内皮细胞恢复生长。ATF4的缺失影响了HIF-1α在骨小梁表面成骨细胞中的表达,但pVHL的表达没有受到影响。缺氧的情况下,在成骨细胞中过表达ATF4可以上调HIF-1α和VEGF的表达。机制上,ATF4的缺失可以增强HIF-1α的泛素化水平,降低HIF-1α蛋白的稳定性,但对于其mRNA的稳定性和蛋白质的翻译过程却没有影响。此外,在缺氧的条件下,ATF4的缺失增强了HIF-1α与脯氨酸羟基化酶(PHD1, PHD2和PHD3)的结合,增强了其402和564两个脯氨酸位点的羟基化水平,使更多的羟基化的HIF-1α走向蛋白酶体降解,由此降低了HIF-1α的蛋白水平。有意思的是,甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)和RANKL——两个破骨细胞的激活剂,依赖ATF4并通过PKC信号通路促进破骨细胞的分化和骨吸收,使骨质中的VEGF释放,促进血管生成。同时,通过体内实验证明,间歇性缺氧处理小鼠后,野生型小鼠中HIF-1α和VEGF的表达增加,骨血管生成增强(CD31阳性面积增加),但ATF4缺失后,HIF-1α,VEGF以及CD31并没有变化,表明小鼠对缺氧环境的适应机制丧失。综合上述实验,我们证实在成骨细胞缺氧的条件下,ATF4是HIF/VEGF信号通路的主要调节因子,同时ATF4可以调控骨质中的VEGF释放,进而促进骨血管生成。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章引言  13-39
  第一节血管生成与骨发育  13-25
    1.1.1 膜内成骨和软骨内成骨  13-14
    1.1.2 促进血管生成的因子在早期骨发育中的作用  14-17
    1.1.3 骨中的血管  17-18
    1.1.4 骨细胞  18-20
    1.1.5 调控成骨细胞分化的转录因子  20-25
  第二节破骨细胞与血管生成  25-29
    1.2.1 破骨细胞对血管生成的促进作用  25-27
    1.2.2 破骨细胞和血管生成  27-29
  第三节缺氧与骨发育  29-36
    1.3.1 HIF和VEGF在骨发育中的作用  31-34
    1.3.2 骨再生与疾病  34-36
  第四节转录激活因子ATF4  36-39
    1.4.1 转录激活因子家族成员  36
    1.4.2 ATF4的结构  36-37
    1.4.3 ATF4的功能  37-38
    1.4.4 本课题的提出  38-39
第二章材料与方法  39-57
  第一节实验材料  39-44
    2.1.1 药品试剂  39-40
    2.1.2 实验所用抗体  40-41
    2.1.3 实验所用仪器  41-42
    2.1.4 实验所用液体试剂配方  42-44
    2.1.5 Atf4基因敲除小鼠  44
  第二节实验方法  44-57
    2.2.1 细胞培养  44
    2.2.2 原代成骨细胞的分离  44-45
    2.2.3 小鼠骨内血管microCT成像  45
    2.2.4 跖骨血管生成分析(Metatarsal Angiogenesis Assay)  45-46
    2.2.5 跖骨切片及TRAP染色  46
    2.2.6 小鼠血清VEGF ELISA检测  46-47
    2.2.7 破骨细胞活性检测  47
    2.2.8 免疫组织化学(IHC)  47-48
    2.2.9 腺病毒的富集及感染  48
    2.2.10 RNA提取、反转录及Real-Time PCR  48-50
    2.2.11 免疫印记(Western-blot)  50-51
    2.2.12 体外转录和翻译  51-55
    2.2.13 免疫共沉淀  55
    2.2.14 细胞活性检测  55
    2.2.15 缺氧实验  55-57
第三章 ATF4对骨血管生成的作用及机制的研究  57-120
  第一节 Atf4基因的缺失影响小鼠骨血管的形成  57-64
    3.1.1 Atf4基因敲除小鼠的骨中血管减少  57-58
    3.1.2 microCT分析表明Atf4基因敲除小鼠头盖骨中血管容积和密度减少  58-59
    3.1.3 microCT分析表明Atf4基因敲除小鼠股骨中血管容积和密度减少  59-60
    3.1.4 Atf4基因敲除小鼠胫骨切片中CD31的阳性面积减少  60-64
  第二节 Atf4基因的缺失使小鼠成骨细胞中VEGF的表达显著减低  64-68
    3.2.1 Atf4基因敲除的小鼠骨中Vegf的mRNA水平降低  64-66
    3.2.2 Atf4基因敲除的小鼠骨中VEGF的原位表达降低  66-67
    3.2.3 Atf4基因敲除的小鼠血清中VEGF的含量没有改变  67-68
  第三节 Atf4基因敲除小鼠的跖骨血管生成能力减弱,但可以被重组的人源VEGF恢复  68-73
    3.3.1 Atf4敲除小鼠的跖骨血管生成能力显著下降  68
    3.3.2 Atf4敲除后不影响小鼠跖骨的细胞存活能力  68-70
    3.3.3 VEGF恢复Atf4敲除的跖骨的血管生成能力  70-72
    3.3.4 FGF2对Atf4敲除的跖骨的血管生成能力没有恢复作用  72-73
    3.3.5 Atf4敲除的跖骨培养基中VEGF的含量降低  73
  第四节 ATF4可以调节骨中HIF-1α的表达  73-79
    3.4.1 ATF4上调HIF-1α对Vegf启动子活性的激活  73-76
    3.4.2 ATF4上调HIF-1α的表达  76-77
    3.4.3 Atf4敲除后HIF-1α的原位表达降低  77-79
  第五节 ATF4调控HIF-1α的稳定性  79-90
    3.5.1 Atf4敲除后缺氧对HIF-1α的诱导减弱  79-81
    3.5.2 缺氧条件下过表达ATF4能够上调HIF-1α  81-82
    3.5.3 缺氧条件下过表达ATF4上调Vegf及Glut1的mRNA  82-85
    3.5.4 缺氧条件下过表达ATF4不会影响Hif-1α的mRNA稳定性  85-86
    3.5.5 缺氧条件下过表达ATF4提高HIF-1α蛋白的稳定性  86-87
    3.5.6 缺氧条件下Atf4敲除的成骨细胞中HIF-1α蛋白的稳定性降低  87-88
    3.5.7 缺氧条件下J押敲除的成骨细胞中HIF-la蛋白的稳定性降低  88-90
  第六节 ATF4抑制HIF-1α的泛素化降解  90-99
    3.6.1 ATF4抑制HIF-1α的泛素化  90-93
    3.6.2 缺氧处理的成骨细胞中ATF4与HIF-1α存在相互作用  93-94
    3.6.3 ATF4不影响PHD1,PHD2,PHD3的水平  94-96
    3.6.4 ATF4降低PHD1,PHD2,PHD3与HIF-1α的结合  96-98
    3.6.5 ATF4与PHD3相互作用,使PHD3对HIF-1α负调控减弱  98-99
  第七节 Atf4敲除后,缺氧对小鼠骨血管生成的诱导能力减弱  99-105
  第八节 ATF4通过激活破骨使VEGF从骨质中释放,调控血管生成  105-110
    3.8.1 破骨细胞的激活剂通过ATF4调节血管生成  105-107
    3.8.2 破骨细胞释放骨质中的VEGF  107-110
  第九节 PKC信号通路通过ATF4调控破骨细胞的分化和活性,调节骨血管生成  110-120
    3.9.1 PMA上调ATF4的表达  111-112
    3.9.2 PMA促进跖骨的血管生成  112-114
    3.9.3 PKC信号途径通过ATF4促进跖骨的血管生成  114-120
第四章分析与讨论  120-124
参考文献  124-138
致谢  138-139
个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果  139

ATF4调节骨血管生成的作用和机制的研究

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