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目的：强直性脊柱炎是一种慢性自身免疫性疾病,调节性T细胞在其发生发展过程中发挥着重要作用。调节性T细胞在表型和功能上具有异质性,由于缺乏特异性标志,鉴定和分离有功能的调节性T细胞及其在AS发病中的作用仍存在较大争议。本研究中,我们发现通过CD39和CD45可进一步将CD4+CD25++细胞分成新型的调节性T细胞亚群,并测定了其在强直性脊柱炎患者中的功能。方法：采取正常人和患者外周血50-100ml,用流式细胞染色进行表型分析；分别用磁珠和流式分选出调节性T细胞各亚群,和效应T细胞共培养,氢3掺入法、CFSE法测定细胞增殖,ELISA测定培养上清IFN-g、IL17分泌。Real-time PCR测定Foxp3亚型。Micoarray测定基因表达谱。高通量测序TCR-beta CDR3,测定TCR受体库。结果：CD39和CD45RO可进一步将CD4+CD25++T细胞分成3个亚群(G1, G2,G3)。G1(CD39+CD45RO+CD4+CD25++)的Foxp3表达变异度大,TCR刺激后可以增殖并分泌大量炎性细胞因子,尤其是IL17。其Foxp3不稳定,TCR刺激后表达迅速下降,无抑制功能。G2(CD39+CD45RO+CD4+CD25++)为Foxp3hi,表型为效应型调节性T细胞,具有最强的抑制功能,TCR刺激后不能增殖并且很快凋亡。G3(CD39+CD45RO-CD4+CD25++)为Foxp3low,TCR刺激后可以增殖但无炎性细胞因子分泌,其抑制功能弱于G2细胞。此外,G3细胞在体外反复TCR刺激后可以在表型和功能上诱导扩增为G2细胞。所以通过CD39和CD45RO可以将Foxp3+Treg和Foxp3+Non-Treg(G1)清楚地区别开,并且将Foxp3+Treg分为effctor Treg(G2)和naive Treg(G3).为进一步比较幼稚型调节性T细胞和效应型调节性T细胞在转录水平上的不同,我们通过microarray方法进一步比较了二者的基因表达谱,发现调节性T细胞功能性相关的蛋白分子在effector Treg中升高,并且effector Treg高表达和凋亡相关的分子,进一步提示调节性T细胞已经分化成熟。通过高通量测序TCR-beta CDR3,比较各亚群间TCR受体库的组成,发现naive Treg(G3)细胞的TCR谱很广,并且都是小克隆,没有优势克隆,并且和其他3群细胞没有克隆覆盖。Foxp3+Non-Treg(G1)和effector Treg(G2)有一定的克隆覆盖。他们和效应T细胞(Tresp)都有小部分克隆覆盖,且G1细胞多余G2。我们还测定了这3群细胞在AS患者中的数量和功能,和正常对照相比,3群细胞的数量无明显差异,但是其Foxp3的阳性率在AS患者中略低于正常人,尤其是naive Treg(G3).在功能上,强直性脊柱炎患者Non-Treg (G1)可以分泌更多的炎性细胞因子IFN-g和IL17,而effctor Treg (G2)和naive Treg (G3)的抑制功能部分受损。结论：在CD4+CD25++的基础上,CD39结合CD45RO可以更精确地定义调节性T细胞亚群,这会测定调节性T细胞在强直性脊柱炎中的作用提供更可靠的表型鉴定。可以将naive Treg在体外扩增诱导为effector Treg,并且保持高效的抑制功能,为体外细胞治疗提供一个可能的策略。强直性脊柱炎患者中的调节性T细胞的数无明显异常,但是其功能受损,包括效应型调节性T细胞和幼稚型调节性T细胞。此外,我们还发现强直性脊柱炎患者外周血中Foxp3+Non-Treg过度活化,可以分泌更多的炎性细胞因子,这可能也参与了强直性脊柱炎的免疫功能紊乱。
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