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疱疹病毒参与肺气肿合并肺纤维化形成的研究

作　者: 吴思思
导　师: 张惠兰
学　校: 华中科技大学
专　业: 内科学
关键词: A549 MHV-68 TGF-β1 生物学特性老年吸烟 CPFE模型 DXM CPFE
分类号: R563
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

第一部分MHV-68体外对A549细胞上皮间质化的确切影响【目的】观察MHV-68体外对A549细胞上皮间质化的确切影响，为我们的后期研究奠定实验基础。【方法】 A549细胞实验分为四大组，分别为A组：空白对照组；B组：MHV-68干预组；C组：TGF-β1阳性对照组，D组：RSV干预组。每一组都设24h,48h,72h,96h四个亚组。运用相差显微镜观察A549细胞形态变化，细胞免疫荧光法检测EMT相关蛋白E-cadherin, α-SMA在细胞里的表达情况，Western blot法检测EMT相关蛋白E-cadherin, α-SMA在蛋白水平中的表达情况。ELISA法检测细胞培养基上清中细胞因子TGF-β1的表达水平。【结果】显微镜镜下观察MHV-68干预组的A549细胞在干预后48h出现形态变化，在72h时细胞形态变化更为显著，表现为细长梭型，并出现分叉，细胞间连接疏松。而空白对照组的A549呈典型的上皮样细胞形态，细胞间连接紧密，镜下呈鹅卵石样生长。细胞免疫荧光显示上皮细胞标志性蛋白E-cadherin在MHV-68干预72h后明显减少，而间充质细胞标志蛋白α-SMA在MHV-68干预后72h明显增加（P＜0.05）。Western blot结果与细胞免疫荧光结果一致。ELISA结果显示MHV-68干预组的培养基上清中TGF-β1的表达较空白对照组明显增加（P＜0.05）。同时，RSV干预组与空白对照组间的各项指标均无明显差异。【结论】 MHV-68体外可以诱导肺上皮细胞系A549出现EMT样改变，其可能机制与MHV-68促A549细胞分泌TGF-β1增多有关，与之对照的RSV体外不能诱导A549细胞发生EMT。第二部分首创MHV-68干预老年吸烟小鼠所致CPFE模型【目的】首创MHV-68干预老年吸烟小鼠所致CPFE模型，为进一步MHV-68在CPFE形成中的可能机制奠定基础。【方法】48只清洁级C57BL/6小鼠随机分为8组，每组6只:A组（正常对照组），B组（COPD组），C组：C1组（COPD+MHV68，7天），C2组（COPD+MHV-68，14天），C3组（COPD+MHV-68，21天），C4组（COPD+MHV-68，28天），D组（COPD+RSV，28天）, E组(COPD+博来霉素组)。通过香烟烟雾熏染12月制造COPD模型，采用肺组织石蜡切片HE染色，肺泡灌洗液中总细胞计数及炎症细胞分类计数来评价肺组织病理变化及炎症浸润情况，肺组织石蜡切片Masson染色来评价肺组织胶原沉积情况。ELISA检测纤维化相关重塑因子TGF-β1的蛋白表达水平。【结果】肺组织切片HE染色可观察到，与A组相比，其余各组均出现肺泡结构的破坏，肺泡融合，肺大疱，在炎症方面，E组炎症最为显著，C组次之，B组与D组的炎症浸润较A组无明显差别。在C组各亚组中可观察到，相对C1组，C3，C4组的炎症浸润显著增多，C2组炎症轻度增加。BALF中细胞计数可发现，相对A组，其余各组肺泡灌洗液中的炎性细胞总数均显著增加，其中E组最高，C组次之，B组与D组之间无明显差别。Masson染色可观察到，与A组相比，C组与E组肺组织胶原沉积明显增多，且E组胶原沉积较C组更为显著，而A组，B组跟E组三者之间无明显差异。ELISA结果提示，C组，E组小鼠BALF中TGF-β1的蛋白表达水平较A组明显增加（P＜0.05），B组，D组小鼠的TGF-β1较A组也有所增加，但差异无统计学意义，C组，E组的TGF-β1的增加较B组，D组差异有统计学意义（P＜0.05）。【结论】 MHV-68干预老年吸烟小鼠可以成功复制CPFE模型，不同时间段的病理改变提示所发生的纤维化可能与MHV-68对气道的炎症损伤及促使气道重塑因子TGF-β1表达增多有关，而RSV在体内不能导致COPD小鼠形成CPFE的病理改变。第三部分糖皮质激素DXM对MHV-68所致小鼠CPFE模型的影响【目的】观察DXM对MHV-68所致小鼠CPFE模型是否起到抑制作用，并分析其原因。【方法】12只清洁级C57BL/6小鼠随机分成二组，每组6只（n=6）：A组（COPD+MHV-68），B组（COPD+MHV-68+DXM）。采用肺组织石蜡切片HE染色，肺泡灌洗液中总细胞计数及炎症细胞分类计数来评价肺部炎症浸润情况，切片Masson染色来评价肺组织胶原沉积情况。ELISA检测纤维化相关重塑因子TGF-β1的蛋白表达水平。【结果】肺组织切片HE染色及BALF炎性细胞计数可观察到，B组炎症浸润程度较A组明显减轻，Masson染色提示B组肺组织胶原沉积较A组明显减少。ELISA结果显示B组TGF-β1水平明显下降（P＜0.05）。【结论】 DXM治疗可抑制MHV-68感染的老年肺气肿小鼠向CPFE方向进展，其可能机制在于DXM对气道炎症和气道重塑因子TGF-β1的抑制。

全文目录

缩略词表  6-7
前言  7-9
中文摘要  9-12
Abstract  12-16
第一部分 MHV-68 体外对 A549 细胞上皮间质化的确切影响  16-30
  材料和方法  16-22
  结果  22-23
  讨论  23-24
  参考文献  24-27
  附图  27-30
第二部分首创 MHV-68 干预老年吸烟小鼠所致 CPFE 模型  30-45
  材料和方法  30-33
  结果  33-34
  讨论  34-37
  参考文献  37-39
  附图  39-45
第三部分糖皮质激素 DXM 对 MHV-68 所致小鼠 CPFE 模型的影响  45-53
  材料和方法  45-47
  结果  47-48
  讨论  48-49
  参考文献  49-51
  附图  51-53
综述  53-59
  参考文献  57-59
致谢  59-60

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