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精神分裂症药物基因组学及孕期营养不良大鼠动物模型的蛋白质组学研究

作　者: 刘保成
导　师: 贺林
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 精神分裂症关联研究蛋白质组学成人胎源性疾病大鼠模型通路分析
分类号: R749.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

精神分裂症是一种严重的精神疾病，影响着全世界约1%的人口。精神分裂症是一组病因未明的精神疾病，临床表现为思维、情感和行为等多方面的障碍以及精神活动的不协调。该种疾病是由遗传因素和环境因素共同作用而发生，家系研究表明此疾病有较高的遗传性，但又不是简单的孟德尔型遗传。本论文主要围绕精神分裂症的基因组学、药物基因组研究以及可能导致成年精神分裂症的胎源性营养缺乏的大鼠蛋白质组研究。HTR2C (5-HT2C)和精神分裂症利培酮治疗疗效的关联研究。该基因位于X染色体长臂2区4带(Xq24)，可翻译表达一种后突触G蛋白偶联受体。我们选取了HTR2C的5个SNP位点:rs3813929(-759C/T), rs518147(-697G/C), rs1023574, rs9698290, rs6318(Ser23Cys)在130名接受利培酮单一治疗的精神分裂症患者中进行关联分析，这些患者在接受利培酮治疗前都接受了为期8周的药物清洗期，以避免和其他药物的相互影响。通过研究我们发现位于HTR2C启动子区域的rs518147和邻近的rs1023574以及rs9698290位于同一个基因连锁区域(Gene block)，且都和中国女性精神疾病患者利培酮疗效改变有直接联系；进而通过显性模型(Dominant model)和隐性模型(Recessive model)对实验结果进行进一步分析发现，在rs518147和rs1023574位点上含有CC (G-)等位基因的女性患者在服用利培酮后，其疗效比CG或GG(G+)基因型的患者要好，而对于rs9698290的位点来说TT(C-)基因型会比CC或者CT(C+)效果要好。但是遗憾的是以上这些现象在男性患者中均没有发现，这可能是因为该基因位于性染色体，而造成的基因剂量(Dosage)影响不一样造成的。早期生长反应基因(Early Growth Response,EGR)是一类重要的转录因子(Transcription factors)，其包含4个基因家族成员，分别为EGR1-4，用于调控神经元可塑性(Neuronal plasticity)基因的表达。在我们研究中首次在中国汉族人群中进行了关联研究来探讨EGR基因家族和精神分裂症之间可能的联系。我们一共选取了具有代表性的12个SNP在2044个样品(1022个正常对照样品，1022个精神分裂症样品)中进行了病例-对照实(Case-control)验。我们没有发现有任何SNP同精神分裂症或者其偏执亚型(Paranoid)和未分化亚型(Undifferentiated)有显著关联结果。最后我们用MDR (MultifactorDimensionality Reduction)来检测EGR基因家族之间的相互作用对精神分裂症致病性的研究，也没有任何阳性结果显示。这表明在我们的样品中，EGR基因不是主要致病性基因，但是我们需要更大样本量实验配合其他功能试验的验证。研究室既往对三年饥荒时期出生的人成年后患精神分裂症流行病学研究表明，1959年出生的新生儿精神分裂症患病率是0.84%，而在饥荒期间出生的婴儿成年后患病率分别是2.15%，1.81%(男女患精神分裂症概率约相似)，分别是对照组的2倍。而这项研究在随后采用更大样本量，在广西柳州及周边18个村庄的研究中得到验证。于是我们构建了大鼠的饥荒研究模型来深入了解饥荒对成人胎源性疾病的分子机理研究。三组SD大鼠被随机的分成正常大鼠、中度缺乏孕期严重缺乏组别，待胎鼠成年后我们对其进行了行为学测试，分别包括旷场模型、强迫游泳模型、水迷宫和社交行为模型实验。然后对其海马及皮层脑区进行全蛋白质组学研究。我们对正常和饥荒大鼠的海马和皮层的蛋白质组学采用同位素标记相对和绝对定量(i-TRAQ)平台寻找表达量发生显著变化的蛋白，然后利用IPA软件对这些差异蛋白进行通路分析。最后我们比较了海马和皮层中发生显著变化的通路，发现这些蛋白主要富集在以下三个通路中：糖代谢通路(CarbohydratePathway)、神经递质通路(Neuro-transmitter Pathway)和线粒体功能异常(MitochondrialDysfunction)。同时我们又使用了Western blot对一些显著发生变化的蛋白例如GNB1、GLUD1、GNAI1、STXBP1和HOMER1在正常组和严重营养缺乏组大鼠的海马和皮层中进行了验证试验。本论文主要围绕精神分裂疾病展开，通过对疾病相关联的SNP位点进行研究,尝试用遗传学的方法找到可能的致病基因，及药物疗效预测基因靶点。同时探索胎源性营养不良对子代成年后行为变化并试图从蛋白组层面对这些现象进行解释，同时为精神分裂症的分子机理研究、抗精神病药物疗效评价预测提供了新的线索。

全文目录

摘要  4-8
ABSTRACT  8-14
目录  14-19
第一篇精神分裂症及其研究综述  19-52
  第一章精神分裂症研究概述  19-42
    1.1 精神分裂症概述  19-20
    1.2 精神分裂症的临床表型及分类  20-21
    1.3 精神分裂症的流行病学  21-22
    1.4 精神分裂症病因学研究  22-27
      1.4.1 遗传致病因素(Genetic risk factor)  22-23
      1.4.2 外界致病因素 (Environment Risk Factors)  23-24
      1.4.3 神经递质假说 (Neurotransmitter Hypothesis)  24-27
        1.4.3.1 5-HT 假说 (Serotonin Hypothesis)  24-25
        1.4.3.2 多巴胺假说 (Dopamine, DA Hypothesis)  25
        1.4.3.3 乙酰胆碱假说 (Acetylcholine, Ach Hypothesis)  25-26
        1.4.3.4 谷氨酸假说 (Glutamic acid, Glu Hypothesis)  26
        1.4.3.5 γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid, GABA Hypothesis)  26-27
    1.5 精神分裂症遗传学研究的主要方法  27-42
      1.5.1 连锁研究 (Linkage Analysis)  28
      1.5.2 关联研究分析 (Association analysis)  28-29
      1.5.3 遗传效力及统计分析矫正  29-30
      1.5.4 全基因组关联研究 (Genome-Wide Association Analysis)  30-38
      1.5.5 基因组结构变异 (Structure Variation)  38-41
      1.5.6 个体化测序应用 (Next Generation Sequencing)  41-42
  第二篇精神分裂症的治疗  42-47
    2.1 精神分裂症的药物治疗  42-44
      2.1.1 典型性抗精神分裂症药物  43
      2.1.2 非典型性抗精神分裂症药物  43-44
    2.2 精神分裂症的其他治疗  44-45
      2.2.1 电抽搐治疗  44
      2.2.2 胰岛素昏迷疗法  44
      2.2.3 心理治疗  44-45
    2.3 精神分裂症的药物基因组研究  45-47
      2.3.1 基因多态性在药物基因组中的研究方法  45-47
        2.3.1.1 候选基因研究  45-46
        2.3.1.2 连锁不平衡法  46-47
  第三篇孕期营养不良与胎源性成人疾病  47-52
    1 成人疾病胎源性说(Fetal Origins of adult disease hypothesis)  47
    2 出生体重与常见疾病的流行病学研究  47-50
      2.1 出生体重与精神分裂疾病的联系  48
      2.2 出生体重与高血压的联系  48-49
      2.3 出生体重与冠心病  49
      2.4 出生体重与糖尿病  49-50
    3 成人疾病胎源说成人疾病的发生机制  50-51
      3.1 发育可塑性假说 (Development plasticity)  50
      3.2 表观遗传学假说 (Methylation hypothesis )  50-51
    4 研究胎源说的模型  51-52
第二部分实验部分  52-128
  第四篇 HTR2C基因与利培酮治疗精神分裂症疗效的关联分析  52-59
    1 前言  52
    2 材料和方法  52-56
      2.1 研究对象  52-53
      2.2 研究方法  53-54
        2.2.1 临床给药  53-54
      2.3 血样采集和 DNA 提取  54-55
      2.4 基因分型  55-56
      2.5 统计分析  56
    3 结果与讨论  56-59
  第五篇 EGR基因与精神分裂症易感性的关联分析  59-67
    1 前言  59-60
    2 材料和方法  60-62
      2.1 研究对象  60
      2.2 研究方法  60
      2.3 血样采集和 DNA 提取  60-62
      2.4 基因分型  62
      2.5 统计分析  62
    3 结果与讨论  62-67
  第六篇孕期营养不良大鼠动物模型研究  67-126
    1 前言  67-68
    2 出生前营养不良动物模型的研究  68-76
      2.1 实验材料  70-72
        2.1.1 模拟孕期饥荒大鼠模型的建立  70
        2.1.2 饲料  70-72
        2.1.3 实验试剂  72
        2.1.4 实验仪器  72
      2.2 试验方法  72-75
        2.2.1 动物的分组喂养  73-74
        2.2.2 筑巢行为 (Nest Building)  74-75
      2.3 结果和讨论  75-76
    3 动物行为学  76-81
      3.1 前言  76
      3.2 矿场试验 (Open field)  76-78
      3.3 水迷宫实验(Water maze test)  78-79
      3.4 社交行为实验(social interaction)  79-80
      3.5 强迫游泳实验 (Forced Swimming Test)  80-81
    4 蛋白质组学  81-118
      4.1 前言  81
      4.2 实验方法  81-104
        4.2.1 样本组织提取  82-83
        4.2.2 组织蛋白提取  83
        4.2.3 蛋白浓度测定  83-87
        4.2.4 i-TRAQ  87-96
          4.2.4.1 i-TRAQ 原理  87-88
          4.2.4.2 蛋白前处理  88-91
          4.2.4.3 标记  91
          4.2.4.4 脱盐  91-92
          4.2.4.5 第一维强阳离子柱(SCX)分离  92-93
          4.2.4.6 第二维反相液质联用 RPLC-MS  93-94
          4.2.4.7 蛋白质搜库  94
          4.2.4.8 原始结果示意  94-96
        4.2.5 iTRAQ 结果  96-104
      4.3 IPA 分析  104-118
        4.3.1 海马 IPA分析  106-112
        4.3.2 皮层 IPA分析  112-116
        4.3.4 IPA关键通路 Western blot 验证  116-117
        4.3.5 Western blot 实验结果  117-118
        4.3.6 皮层与海马的对比研究 (Comparative analysis )  118
    5 实验讨论  118-126
  第七篇总结与展望  126-128
致谢  128-130
攻读学位期间发表和待发表的论文目录  130-132
附录  132-134
参考文献  134-142

精神分裂症药物基因组学及孕期营养不良大鼠动物模型的蛋白质组学研究

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