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红松松塔多糖的提取、分离纯化及抗氧化活性研究

作　者: 王薇薇
导　师: 张曜武
学　校: 青岛科技大学
专　业: 药剂学
关键词: 红松松塔多糖改良差示酚硫法提取工艺分离纯化抗氧化
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

红松(Pinus koraiensis)为松科(pinaceae)松属(Pinus)植物,主要分布在我国东北部地区。松塔为红松的球果,其中所含有的活性多糖成分的抗肿瘤、抗病毒等功效已有众多研究者先后报道。本课题以红松松塔为原料,探索建立了其中红松松塔多糖成分的适宜提取、分离纯化方法,开展了系列研究工作,同时还首次报道了该提取物的体外抗氧化活性,相关主要工作如下：(1)建立了一种红松松塔多糖的含量测定方法-改良差示酚硫法,本课题初次尝试运用本方法测定红松松塔多糖含量。该方法弥补了传统酚硫法、改良酚硫法和现有差示酚硫法的不足,既能简化多糖样品预处理步骤和容易伴随的多糖成分丢失,又能减少非糖杂质的干扰,同时还能克服在显色反应中因浓硫酸放热而导致的诸多难点。本课题研究中从检测波长、水解时间、显色液放置时间和用量、以及线性范围、稳定性、重现性、回收率等多方面对该方法进行了考察,结果表明该法可用于红松松塔多糖含量测定,方法简便、准确,重复性好。(2)采用水提醇沉法制备红松松塔多糖提取物,并对其脱蛋白、脱色等精制工艺进行了研究。红松松塔多糖提取物的制备工艺：水煎煮3次,时间30min,料液比1：10,此条件下,多糖得率为3.68%。多糖脱蛋白工艺：通过对三氯乙酸法、Sevage法和木瓜蛋白酶法等不同方法的比较,得知木瓜蛋白酶法为较理想的方法,其优化后的工艺条件为：木瓜蛋白酶用量2.4m1,酶液浓度(10mg-mL-1),pH值5.5,酶解时间1.5h,酶解温度50℃,此条件下,蛋白去除率为56.83%,多糖损失率为18.33%。多糖脱色工艺：通过对活性炭法、双氧水法、大孔树脂法及阴阳离子交换树脂法的比较,得到大孔树脂D101为脱除红松松塔多糖色素的有效方法,该法优化工艺条件为：大孔树脂用量2.0g,脱色时间5h,脱色温度40℃,pH5.0,此条件下,色素脱除率为72.16%,多糖损失率为28.03%。(3)研究了红松松塔粗多糖分离纯化的综合工艺路线并对纯化后组分进行纯度检测。红松松塔粗多糖经木瓜蛋白酶法加两次Sevage法脱蛋白,超滤分级,去除小分子杂质,D101大孔树脂脱色,并经DEAE-52柱层析后得到6个多糖组分,其中主要组分为三种。三种多糖组分与粗多糖相比,多糖含量有显著提高,并经紫外检测、冻融分析及双缩脲反应,结果表明三种多糖为均一组分。(4)通过对红松松塔多糖的还原能力、羟自由基(·OH)以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)的清除能力的测定,研究了红松松塔多糖的体外抗氧化活性。结果表明,红松松塔多糖具有一定的还原能力；多糖对·OH以及DPPH·都具有较强的清除作用,并且清除能力随多糖浓度的增大而增大。纯化后的松塔多糖对·OH和DPPH·的清除能力不如粗多糖,但其仍具有一定的清除作用,有关原因探索,正在后续研究之中。该毕业论文中,对红松松塔多糖的分析方法、提取、纯化方法,以及其体外抗氧化活性等多个方面进行了系列探索性研究,并且获得了明显进展,其中多项内容尚未见有文献报道,期望能为进一步合理开发利用红松松塔资源提供理论依据和科学数据。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-13
第1章绪论  13-24
  1.1 红松研究概况  13
    1.1.1 红松植物简介  13
    1.1.2 红松松塔化学成分研究进展  13
    1.1.3 红松松塔多糖生物活性研究进展  13
  1.2 多糖的研究进展  13-23
    1.2.1 多糖的简介  13-14
    1.2.2 多糖的提取  14-15
    1.2.3 多糖的含量分析方法  15-16
      1.2.3.1 分光光度法  15-16
      1.2.3.2 色谱法  16
      1.2.3.3 酶法  16
    1.2.4 多糖的纯化  16-19
      1.2.4.1 除蛋白  16-17
      1.2.4.2 脱色  17-18
      1.2.4.3 小分子杂质的去除  18
      1.2.4.4 多糖的分级纯化  18-19
    1.2.5 多糖的分子量及单糖组成测定  19-21
    1.2.6 多糖的药理作用  21-23
  1.3 本课题的研究目的、内容及意义  23-24
    1.3.1 本课题的研究目的和内容  23
    1.3.2 本课题的研究意义  23-24
第2章改良差示酚硫法测定红松松塔多糖含量  24-32
  2.1 材料与仪器  24
    2.1.1 材料  24
    2.1.2 仪器  24
  2.2 原理  24
  2.3 实验内容  24-31
    2.3.1 松塔粗多糖的初步纯化  24-25
    2.3.2 相关溶液的制备  25
      2.3.2.1 样品液的制备  25
      2.3.2.2 对照品溶液的制备  25
      2.3.2.3 其它溶液的制备  25
    2.3.3 实验条件的考察  25-28
      2.3.3.1 最大吸收波长的确定  25
      2.3.3.2 水解条件的考察  25-26
      2.3.3.3 显色条件的考察  26-28
    2.3.4 红松松塔多糖含量测定方法  28-29
    2.3.5 结果计算  29
    2.3.6 方法学研究  29-30
      2.3.6.1 线性关系的考察  29
      2.3.6.2 精密度实验  29
      2.3.6.3 重复性实验  29
      2.3.6.4 稳定性实验  29
      2.3.6.5 加样回收率实验  29-30
    2.3.7 样品测定实例  30
    2.3.8 讨论  30-31
  2.4 本章小结  31-32
第3章红松松塔多糖提取物的制备及其精制工艺研究  32-54
  3.1 材料和仪器  32
    3.1.1 材料  32
    3.1.2 仪器与设备  32
  3.2 蛋白质含量测定——考马斯亮蓝法  32-34
    3.2.1 测定原理  33
    3.2.2 标准曲线的绘制  33-34
    3.2.3 样品中蛋白质含量测定和蛋自去除率的计算  34
  3.3 多糖损失率测定  34
  3.4 脱色率的测定  34-35
  3.5 红松松塔多糖提取物的制备  35-36
    3.5.1 松塔多糖的提取  35
      3.5.1.1 煎煮浓缩  35
      3.5.1.2 醇沉  35
      3.5.1.3 沉淀处理  35
    3.5.2 结果与分析  35
    3.5.3 放大实验  35-36
      3.5.3.1 提取方法  35
      3.5.3.2 结果与分析  35-36
  3.6 红松松塔多糖脱蛋白工艺研究  36-44
    3.6.1 脱蛋白方法筛选  36-37
      3.6.1.1 三氯乙酸法脱蛋白  36
      3.6.1.2 木瓜蛋自酶法脱蛋白  36
      3.6.1.3 脱蛋白方法比较  36-37
    3.6.2 木瓜蛋白酶法脱蛋白单因素考察  37-41
      3.6.2.1 酶用量的考察  38
      3.6.2.2 酶解时间的考察  38-39
      3.6.2.3 pH的考察  39-40
      3.6.2.4 酶解温度的考察  40-41
    3.6.3 正交设计优选红松松塔多糖酶法脱蛋白工艺  41-44
      3.6.3.1 实验方法  41-43
      3.6.3.2 结果分析  43-44
      3.6.3.3 优选工艺的验证  44
  3.7 脱色方法研究  44-52
    3.7.1 脱色方法筛选  44-46
      3.7.1.1 活性炭脱色  44
      3.7.1.2 双氧水脱色  44
      3.7.1.3 阴离子树脂脱色  44-45
      3.7.1.4 阳离子树脂脱色  45
      3.7.1.5 大孔吸附树脂脱色  45
      3.7.1.6 脱色方法的比较  45-46
    3.7.2 大孔吸附树脂脱色方法研究  46-52
      3.7.2.1 树脂用量对脱色效果的考察  46-47
      3.7.2.2 脱色时间对脱色效果的考察  47-48
      3.7.2.3 脱色温度对脱色效果的考察  48-49
      3.7.2.4 pH对脱色效果的影响  49-50
      3.7.2.5 正交设计优选红松松塔多糖脱色工艺  50-52
      3.7.2.6 树脂的再生及重复利用  52
  3.8 本章小结  52-54
第4章红松松塔多糖综合纯化工艺研究  54-66
  4.1 材料与仪器  54
    4.1.1 材料  54
    4.1.2 仪器  54
  4.2 酶解法结合SEVAGE法脱蛋白  54-55
    4.2.1 多糖样品液的制备  54
    4.2.2 脱蛋白试验  54-55
    4.2.3 结果  55
  4.3 超滤分级试验  55-60
    4.3.1 原理  55-56
    4.3.2 预处理  56
    4.3.3 超滤试验  56
    4.3.4 结果与讨论  56-60
      4.3.4.1 多糖分子量分级  56-57
      4.3.4.2 渗出通量变化趋势观察  57-59
      4.3.4.3 讨论  59-60
      4.3.4.4 膜的污染及清洗  60
  4.4 大孔吸附树脂脱色  60
    4.4.1 大孔吸附树脂预处理  60
    4.4.2 脱色试验  60
  4.5 DEAE-52纯化红松松塔多糖  60-64
    4.5.1 原理  60-61
    4.5.2 预处理  61
    4.5.3 装柱  61
    4.5.4 上样  61
    4.5.5 层析结果与分析  61-64
    4.5.6 DEAE-52的再生及重复使用  64
  4.6 红松松塔多糖纯度测定  64-65
    4.6.1 紫外分光光度法检测  64-65
    4.6.2 冻融分析法  65
    4.6.3 双缩脉反应  65
  4.7 本章小结  65-66
第5章红松松塔多糖抗氧化活性研究  66-71
  5.1 实验材料与仪器  66
    5.1.1 材料与试剂  66
    5.1.2 仪器  66
  5.2 实验内容  66-70
    5.2.1 还原能力的测定  66-68
      5.2.1.1 原理  66
      5.2.1.2 试剂的配制  66-67
      5.2.1.3 实验方法  67
      5.2.1.4 结果与分析  67-68
    5.2.2 清除·OH自由基  68-69
      5.2.2.1 原理  68
      5.2.2.2 试剂的配制  68
      5.2.2.3 实验方法  68-69
      5.2.2.4 结果与分析  69
    5.2.3 消除DPPH·自由基  69-70
      5.2.3.1 原理  69
      5.2.3.2 试剂的配制  69-70
      5.2.3.3 实验方法  70
      5.2.3.4 结果与分析  70
  5.3 本章小结  70-71
结论  71-72
参考文献  72-77
致谢  77-78
攻读学位期间发表的学术论文目录  78-79

红松松塔多糖的提取、分离纯化及抗氧化活性研究

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