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芪蓟肾康颗粒总黄酮对IgA肾病大鼠的治疗及抑制ECM机制的研究

作　者: 杨冠琦
导　师: 张君
学　校: 辽宁中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 芪蓟肾康颗粒总黄酮总提取物实验性IgA肾病肾小球系膜细胞血管紧张素Ⅱ 纤维粘连蛋白 IV型胶原丝裂原活化蛋白激酶核因子-kB
分类号: R277.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：1.本实验采用大孔吸附树脂法纯化了芪蓟肾康颗粒总黄酮，并观察芪蓟肾康颗粒总黄酮对IgA肾病大鼠尿红细胞计数、24小时尿蛋白定量、肾脏病理改变的影响，证明此方治疗由口服牛血清白蛋白所致实验性IgA肾病的有效性；2.采用血管紧张素Ⅱ作为刺激因子，诱导体外培养的大鼠肾小球系膜细胞过度分泌纤维连接蛋白和IV型胶原，使细胞外基质发生积聚。应用血清药理学方法，选择不同的时间点，通过观察芪蓟肾康颗粒总黄酮药理血清对体外培养的肾小球系膜细胞纤维连接蛋白和IV型胶原的影响，探讨芪蓟肾康颗粒总黄酮治疗免疫损伤性肾小球疾病的作用靶点。3.通过检测体外培养的肾小球系膜细胞信号传导通路丝裂原活化蛋白激酶以及核因子-kB的表达，探讨其保护肾脏，治疗免疫损伤性肾小球疾病的作用机制。并为探寻芪蓟肾康颗粒治疗肾小球疾病提供可靠的实验数据，为今后指导临床提供新的思路和方法。材料与方法：1采用大孔吸附树脂法纯化芪蓟肾康颗粒总黄酮：芪蓟肾康颗粒上样，吸附率为1BV·h-1，用2BV水量、3BV的30%乙醇、4BV的50%乙醇洗脱，洗脱流速4BV·h-1，合并30%乙醇和50%乙醇洗脱液，浓缩，即为纯化的总黄酮。纯化后总黄酮含量提高到76%。2采用口服牛血清白蛋白复制实验性IgA肾病大鼠模型及分组治疗：口服免疫原牛血清白蛋白（BSA）剂量较常用剂量增加1倍，为400mg/kg，隔日1次灌胃，四氯化碳（CCl4）注射方式由既往的腹腔注射改为皮下注射，用诱导肝纤维化1/3的剂量（皮下注射蓖麻油0.5mL+CCl40.10mL，每周1次，持续9周），并联合运用脂多糖（LPS），第6，8周予以0.05mg尾静脉注射复制模型。SPF级SD大鼠40只，体重180g-220g，雌雄各半。将大鼠按体重随机分为5组，分别为：正常组、模型组、芪蓟肾康颗粒总黄酮高、芪蓟肾康颗粒总黄酮低剂量组、替米沙坦组，每组8只。正常组、模型组给予生理盐水1ml/100g（体重）每日一次灌胃，芪蓟肾康颗粒总黄酮高、低剂量组分别按生药量60g·kg-1·d、30g·kg-1·d灌胃，替米沙坦组按8mg·kg-1·d灌胃，每日一次。于实验第12周末次给药后，收集标本，测定各项指标。3应用血清药理学方法，制取正常大鼠、芪蓟肾康颗粒总黄酮高、低剂量组的药理血清芪蓟肾康颗粒总黄酮高、低剂量组按生药量30g·kg-1·d、15g·kg-1·d灌胃，每天一次；正常组灌服等量的生理盐水。连续灌胃5天，末次给药1小时后，腹主动脉取血。血液使用离心机，1500rpm离心5分钟，吸取上清液。经56℃水浴，30min灭活处理。用0.22μm的滤器过滤除菌，置-20℃保存备用。4采用血管紧张素Ⅱ作为刺激因子，诱导体外培养的大鼠肾小球系膜细胞，使其发生细胞外基质的积聚。将肾小球系膜细胞接种于25cm2培养瓶中，加入含10%FBS的DMEM培养液，放置于37℃、5%CO2孵箱中进行培养。约2-3天换一次液，待细胞达到80%-90%融合后，按2×104个·孔-1的浓度接种于24孔培养板，每组设置5个复孔。用含0.5%FBS的DMEM培养24小时后，更换含10%药理血清DMEM培养液继续培养24h、48h、72h，分别在不同时间点收集细胞待测。5采用终点法测定IgA肾病大鼠24小时尿蛋白定量末次给药后将大鼠置于代谢笼中单笼饲养(禁食，不禁水)，用代谢笼收集24小时大鼠尿液。24小时候后准确记录每只大鼠24小时的总尿量，并留取尿样5ml，以备测定尿红细胞计数和24小时尿蛋白定量。实验条件：温度：37℃、波长：600nm、光径：1.0cm、吸光度范围：0-2A、反应时间：5min、样品：试剂=1:604。6肾脏组织病理学评价指标将病变的肾组织使用20％甲醛固定，常规石蜡包埋切片，经HE染色，观察IgA肾病病理改变。7免疫荧光染色用直接法进行染色，取大鼠肾皮质常规冰冻切片3μm，用电吹风干燥，切片经丙酮固定5min，PBS液冲洗3次，每次5min，滴加羊抗鼠免疫荧光IgA、IgM和C31：10稀释荧光标记(异硫氰的荧光素标记)的抗体于组织切片上，置温度37℃中孵育45min，取出切片置于PBS液中洗3次，每次5min，取出切片用缓冲液甘油封片。8应用免疫酶联吸附法测定纤维粘连蛋白、IV型胶原的分泌量，丝裂原活化蛋白激酶以及核因子-kB的表达。（1）分别设置空白孔、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准空中加入标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl轻轻晃动均匀，37℃温育30分钟。（2）弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，震荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复5次，拍干。（3）每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动均匀，37℃温育30分钟。（4）弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，震荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复5次，拍干。（5）每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻晃动均匀，37℃避光显色10分钟。（6）取出酶标板，每孔加入终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。（7）测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。测定在加终止液后15分钟内进行。（8）根据标准品的浓度及对应的OD值计算样品浓度。结果：1.与正常组（26.30±10.64个/μl，168.38±55.71mg/24小时）比较，模型组大鼠的尿红细胞计数（113.57±32.5个/μl）和24小时尿蛋白排出量（593.51±114.01mg/24小时）显著高于正常组，p＜0.05；经芪蓟肾康颗粒总黄酮高、低剂量和替米沙坦治疗5周后，各治疗组大鼠的尿红细胞计数（高剂量组48.42±22.27个/μl，低剂量组51.38±25.94个/μl，替米沙坦组59.15±11.01个/μl）和24小时尿蛋白排出量（高剂量组286.46±134.33mg/24小时，低剂量组358.43±167.79mg/24小时，替米沙坦组263.91±126.42mg/24小时）显著降低，与模型组比较均有统计学差异（p＜0.05），各治疗组间比较无统计学差异。结果提示，芪蓟肾康颗粒总黄酮能有效的减轻IgA肾病大鼠血尿和蛋白尿的症状。2．肾脏组织病理形态学观察：正常组肾小球结构正常，模型组可见肾小球肿胀、体积增大及重度弥漫性系膜增生，染色显示有部分肾小球呈分叶状，系膜细胞增多，系膜基质增宽。而芪蓟肾康颗粒总黄酮高剂量组系膜增生较轻。芪蓟肾康颗粒总黄酮低剂量组肾小球肿胀，中度系膜增生。替米沙坦组肾小球肿胀较轻，伴中、轻度系膜增生。3.免疫荧光检查示：正常组肾小球系膜区IgA、IgG、IgM和C3均呈阴性。模型组全部大鼠肾小球内均有IgA沉积,其强度为++～+++，主要在肾小球系膜区呈颗粒状沉积，个别还波及毛细血管壁并伴有IgG、IgM和C3沉积。治疗后各组IgA沉积荧光强度均有不同程度的减弱，尤其是芪蓟肾康颗粒总黄酮高剂量组效果更显著，部分IgA荧光强度在±～-。4.正常组大鼠肾小球系膜细胞分泌了少量的Ⅳ胶原和纤维粘连蛋白，表明在正常情况下，体外培养的肾小球系膜细胞具有分泌Ⅳ胶原和纤维粘连蛋白的功能。经血管紧张素Ⅱ刺激后，Ⅳ胶原和纤维粘连蛋白的分泌量显著增加，约为正常组的2倍，与正常组比较有显著性差异（p＜0.01），提示血管紧张素Ⅱ能明显促进系膜细胞分泌Ⅳ胶原。芪蓟肾康颗粒总黄酮高、低剂量组在24小时、48小时、72小时不同时间点，Ⅳ胶原和纤维粘连蛋白的含量均显著降低，与血管紧张素Ⅱ组比较有显著差异（p＜0.01），并且呈现出一定的量效关系。但各治疗组间比较无统计学差异。芪蓟肾康颗粒总黄酮抑制细胞外基质积聚的作用从24小时开始已经显现，并延续至72小时。5.血管紧张素Ⅱ激活了丝裂原活化蛋白激酶以及核因子-kB的信号转导通路，丝裂原活化蛋白激酶（3.365±0.265）以及核因子-kB（3.355±0.265）的含量与正常组（MAPK,1.805±0.065, NF-kB1.660±0.100）比较有统计学差异，（p＜0.01）。给予芪蓟肾康颗粒总黄酮提取物和氯沙坦干预48小时后，两条通路的信号转导受到了抑制，二者（MAPK高剂量组：2.590±0.150，低剂量组：2.465±0.285，氯沙坦组：2.215±0.015；NF-kB高剂量组：2.435±0.165，低剂量组：2.450±0.160，氯沙坦组：1.995±0.095）的含量显著降低，同时纤维粘连蛋白和Ⅳ型胶原的含量也显著降低，与血管紧张素Ⅱ组比较均有统计学意义，p＜0.01，虽然各治疗组间比较无统计学差异，但是氯沙坦组的作用要稍优于芪蓟肾康颗粒总黄酮高、低剂量组。结论：1.芪蓟肾康颗粒总黄酮能效地降低IgA肾病大鼠尿红细胞计数，减少24小时尿蛋白的排出量，减轻肾脏病理改变，减少免疫复合物的沉积。证实了芪蓟肾康颗粒总黄酮对实验性IgA肾病具有一定的治疗作用。2.芪蓟肾康颗粒总黄酮可以抑制AngⅡ诱导的肾小球系膜细胞细胞外基质—IV型胶原、纤维粘连蛋白的过度表达，通过抑制细胞外基质的过度表达来延缓免疫损伤性肾小球疾病的发展，明确了芪蓟肾康颗粒总黄酮的作用靶点。也为芪蓟肾康颗粒应用于临床治疗肾小球疾病提供了实验数据。3.芪蓟肾康颗粒总黄酮有效的抑制了丝裂原活化蛋白激酶和核因子-kB两条信号转导通路的转导，减少细胞外基质的过度积聚，减轻肾小球的损伤，从而防止免疫损伤性肾小球疾病的进一步发展，对肾脏起到保护作用。

全文目录

中文摘要  4-8
Abstract  8-14
前言  14-15
第一部文献综述  15-32
  综述一黄酮类化合物治疗肾脏病的研究进展  15-25
  综述二实验性 IgA 肾病中医研究概述  25-32
第二部实验研究  32-71
  实验一芪蓟肾康颗粒总黄酮对实验性 IgA 肾病大鼠治疗作用的实验研究  32-47
    1 实验材料  32-33
    2 实验方法  33-35
    3 结果  35-39
    分析讨论  39-46
    结论  46-47
  实验二芪蓟肾康颗粒总黄酮对 AngⅡ诱导大鼠肾小球系膜细胞细胞外基质的影响  47-60
    1 实验材料  47-48
    2 实验方法  48-49
    3 结果  49-51
    分析讨论  51-59
    结论  59-60
  实验三芪蓟肾康颗粒总黄酮对大鼠肾小球系膜细胞 MAPK 及 NF-kB 信号通路的影响  60-71
    1 实验材料  60-61
    2 实验方法  61-62
    3 结果  62-63
    分析讨论  63-70
    结论  70-71
全文结论  71-72
参考文献  72-83
致谢  83-84
个人简历  84

芪蓟肾康颗粒总黄酮对IgA肾病大鼠的治疗及抑制ECM机制的研究

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