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金刚健骨片含药血清对成骨细胞增殖、分化的影响

作　者: 李平
导　师: 杨少锋
学　校: 湖南中医药大学
专　业: 中医骨伤科学
关键词: 金刚健骨片 含药血清 细胞培养 成骨细胞 增殖 分化
分类号: R274.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


目的：探讨金刚健骨片含药血清对体外培养成骨细胞增殖与分化的影响,为中药治疗骨质疏松提供实验依据。方法：采用中药血清药理学方法制备金刚健骨片中药含药大鼠血清；用多次酶消化法体外培养成骨细胞；将四组(①雷奈酸锶组②金刚健骨片组③骨松宝组④对照组即生理盐水组)含药血清分别加入新生大鼠成骨细胞培养液中,研究它们对成骨细胞增殖与分化成熟的影响；每天在倒置显微镜下观察成骨细胞的形态及生长变化；各组药物的培养液干预培养5d电镜下观察成骨细胞碱性磷酸酶染色阳性率；细胞贴壁后更换含各组药物的培养液干预培养30d,行茜素红染色观察成骨细胞矿化结节的形成情况；细胞贴壁后更换含各组药物的培养液干预培养2d,行细胞免疫荧光法(FITC标记法)观察I型胶原蛋白的表达；细胞贴壁后,各组药物培养液干预细胞培养1d、2d、3d,检测实验组与对照组成骨细胞增值率。结果：①成骨细胞形态学观察显示：24h可见细胞呈梭形或多角形；成骨性诱导5d后,可观察到细胞数量明显增加,体积开始增大,并增殖、融合成片；间见细胞结节及小钙化颗粒；②电镜下观察成骨细胞碱性磷酸酶染色阳性率,可见实验各药物组较对照组(生理盐水组)染色明显；实验组间比较,金刚健骨片组及雷奈酸锶组阳性率最为显著,两者之间差异不明显。⑨金刚健骨片组及雷奈酸锶组的矿化结节数量及结节面积明显强于对照组和骨松宝组,且两者之间差异不明显。④与对照组比较,实验各药物组荧光显微镜下观察：成骨细胞内I型胶原蛋白染色均表达阳性,I型胶原数量及强度较与对照组有明显差异。各药物组中以金刚健骨片组及雷奈酸锶组染色最为显著,两者之间差异不明显。⑤细胞培养1d、2d、3d检测。培养1d检测,实验各药物组与对照组细胞增殖率有统计学差异(P<0.05),以西药对照组雷奈酸锶组最为明显；细胞培养2d、3d检测,实验组与对照组差异较前显著(P<0.05),组间比较金刚健骨片组成骨细胞增值率较雷奈酸锶组、骨松宝组差异明显(P<0.05)结论：①本实验所获得的细胞具有成骨细胞表现,可表达成骨功能性蛋白,符合成骨细胞的典型特征,可以应用于后续实验;②金刚健骨片可促进碱性磷酸酶染色阳性率,提高矿化结节表达及I型胶原蛋白的阳性表达,故金刚健骨片可促进成骨细胞的成熟、分化,其作用与雷奈酸锶无明显差异,但强于骨松宝；③金刚健骨片可促进成骨细胞的增殖,初期以雷奈酸锶最明显,金刚健骨片次之,骨松宝较差,随着培养时间的推移,金刚健骨片对成骨细胞的促进作用增强,其正向作用强于雷奈酸锶及骨松宝。

全文目录


中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
缩略词表  10-11
引言  11-13
第一部分 材料与方法  13-22
  1 实验材料  13-16
    1.1 实验动物  13
    1.2 主要试剂  13
    1.3 主要实验仪器  13-14
    1.4 实验用药  14
    1.5 实验用药使用说明  14-16
  2 实验方法  16-18
    2.1 含药血清的制备  16-17
    2.2 成骨细胞体外提取及培养  17-18
    2.3 实验分组及干预方案  18
  3 观察指标与检测  18-21
    3.1 成骨细胞形态观察  18-19
    3.2 成骨细胞碱性磷酸酶染色  19
    3.3 成骨细胞矿化结节染色  19-20
    3.4 细胞免疫荧光测定  20
    3.5 成骨细胞增值率的检测  20-21
  4 统计学处理  21-22
第二部分 结果  22-26
  1 成骨细胞的鉴定  22-24
    1.1 成骨细胞形态学观察  22
    1.2 成骨细胞碱性磷酸酶染色  22-23
    1.3 成骨细胞矿化结节染色  23-24
  2 Ⅰ型胶原蛋白免疫荧光染色  24-25
  3 成骨细胞增值率检测  25-26
第三部分 分析与讨论  26-38
  1 祖国医学对本病的认识  26-27
  2 现代医学对本病的认识  27-29
  3 金刚健骨片的组方特色及相关研究  29-32
  4 成骨细胞增殖分化的主要指标  32-35
  5 补肾中药具有促进成骨细胞增殖及分化的作用  35-36
  6 不足与展望  36-38
第四部分 结论  38-39
致谢  39-40
参考文献  40-42
综述  42-51
  参考文献  50-51
部分图片  51-52
攻读学位期间发表的学术论文  52

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