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基于TGF-β/Smad/ERK信号转导通路的补阳还五汤拮抗肺纤维化机制研究

作　者: 杨晗
导　师: 王飞
学　校: 成都中医药大学
专　业: 中医内科学
关键词: 补阳还五汤 肺纤维化 TGF-β/Smad/ERK通路 TGF-β1/Smad/ERK TGF-β1 TβRⅠ TβRⅡ Smad3 Smad7 ERK1/2 p-ERK
分类号: R259
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)禹于纤维增殖性疾病的范畴,是多种原因所致的间质性肺疾病(interstitial lung disease,ILD)共有的病理基础过程,其病变主要累及肺间质,也可累及肺泡上皮细胞及肺血管,以肺成纤维细胞的异常增生和胶原蛋白为主的细胞外基质过度沉积为主要表现,至今发病机制不明,且没有理想的治疗方法。由于大多数肺部疾病最终转归为肺纤维化,并且随着污染、环境恶化等因素,肺纤维化当今在全球的发病率呈不断上升的趋势,已成为严峻的健康问题,因此对肺纤维化发生机制和有效药物的研究具有非常重要的科学价值。研究显示转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是致纤维化关键性的细胞因子,Smads通路介导的致纤维化作用与ERK通路介导的促增殖作用在纤维化的发生发展中均是不可或缺的。肺纤维化属中医“肺痿”、“肺痹”等范畴,其病机为气虚血瘀,故益气活血法是治疗肺纤维化的基本大法。我们在前期对益气活血法干预肺纤维化的研究中发现：补阳还五汤具有抑制实验性肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1的过度表达,减少肺组织中羟脯氨酸含量,降低肺泡巨噬细胞肿瘤坏死因子含量的作用,提示补阳还五汤干预肺纤维化的作用可能与其调控TGF-β/Smad/ERK信号通路有关。基于此,我们以TGF-β/Smad/ERK信号通路为切入点,将研究靶点精准定位于肺纤维化形成的关键病理环节,探讨补阳还五汤拮抗肺纤维化的可能作用机制,以期拓展补阳还五汤的适用范围,为临床研究奠定基础。本研究以博莱霉素(bleomycetin, BLM)诱导肺纤维化大鼠模型为评价载体,从病理学、分子生物学角度探讨补阳还五汤调控TGF-β/Smad/ERK信号通路的作用机制。实验共分为四部分：1.补阳还五汤对博莱霉素所致肺纤维化大鼠肺指数及肺组织形态学的影响建立肺纤维化大鼠模型,通过补阳还五汤干预后,动态观察模型大鼠的一般情况(精神、摄食、毛色、活动、体重等)、肺指数,采集肺组织行HE染色和Masson染色,分析病肺组织肺泡炎及肺纤维化程度,探讨补阳还五汤抗肺纤维化的作用。结果：①-般情况：假手术组大鼠皮毛光泽,行动灵活,反应敏捷,食量正常；模型组大鼠食欲下降,毛发凌乱、稀疏、部分脱毛严重,对外界刺激反应慢、行动迟缓,体重增长缓慢；其余各给药组随实验时间的推进,活动减少、食量下降等症状有不同程度的改善,体重逐渐增加；②肺指数：与假手术相比,模型组大鼠各时间点肺指数增加明显⑦<0.01)；与模型组比较,各给药组大鼠肺指数有不同程度的下降(矿0.01)：与强的松对照组相比,补阳还五汤中剂量组第14d、28d、低剂量组第28d肺指数降低较明显p<0.05)；高剂量组三个时间点肺指数均高于强的松对照组,但与同期模型组相比仍较有明显的降低。③病理形态学：与假手术相比,模型组及各给药组大鼠可见肺泡结构有不同程度的破坏,肺间质增生,有炎细胞漫润和胶原纤维增生形成；与模型组相比,给药组各时间点的肺泡炎和肺纤维化程度均有不同程度的改善p<0.01);其中补阳还五汤中剂量组在中后期降低肺泡炎及纤维化程度方面明显优于同期强的松对照组p<0.05)。结论：博莱霉素诱导肺纤维化大鼠模型制备成功；补阳还五汤能够较好地控制模型大鼠肺指数的增长,抑制早期的肺泡炎和中后期的肺纤维化。2.补阳还五汤对博莱霉素所致肺纤维化大鼠血清纤维化指标PCⅢ、Ⅳ-C、HA、LN含量的影响建立肺纤维化大鼠模型,通过补阳还五汤干预后,采用放免法检测各组大鼠血清纤维化指标PCⅢ、Ⅳ-C、HA、LN的含量,验证补阳还五汤对肺纤维化的治疗作用。结果：①与假手术组相比,其它各组大鼠血清PCⅢ、Ⅳ-C、HA、LN的含量均逐渐升高,以模型组最为明显p<0.01)；②与模型组相比,各给药组大鼠血清PCⅢ、Ⅳ-C、HA、LN含量均有不同程度降低p<0.01);③与强的松对照组相比,补阳还五汤中剂量组第14d、28d以及补阳还五汤低剂量组第28d时,PCⅢ, Ⅳ-C、HA、LN含量下降明显p<0.05)。结论：经补阳还五汤治疗后的模型大鼠血清纤维化指标含量有所下降,提示补阳还五汤可以有效抑制病肺组织中胶原纤维的增殖以及细胞外基质的沉积,起到较好的抗肺纤维化作用。3.补阳还五汤调控肺纤维化TGF-β1/Smad通路机制研究建立肺纤维化大鼠模型,通过补阳还五汤干预后,采用免疫组化染色法(S-P法)检测不同时间点各组大鼠肺组织Col-Ⅰ、TPRⅠ、TpRⅡ、Smad3、Smad7的表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR法)检测肺组织TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA的含量,探讨补阳还五汤通过调控TGF-β1/Smad信号通路干预肺纤维化的作用机制。结果：①与假手术组相比,模型组大鼠肺组织Col-Ⅰ、TβPⅠ、TβRⅡ TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表达水平明显上升,差异有统计学意义(p<0.01)；Smad7、Smad7mRNA表达下降(p＜0.01)；②与模型组相比,各给药组Col-Ⅰ、TβRⅠ、 TβRⅡ、TGF-β1mRNA、Smad3mRNA有不同程度的下降(p<0.01or p<0.05);Smad7? Smad7mRNA表达增高(p<0.01or p<0.05);③与强的松对照组相比,补阳还五汤中、低剂量组肺内Col-Ⅰ、TβRⅠ、TβRⅡ、TGF-β1mRNA、Smad3mRNA的表达降低(p<0.01or p<0.05), Smad7、Smad7mRNA的表达增高(p<0.05)。结论：补阳还五汤能够有效抑制TGF-β1/Smad信号通路中发挥效应的Col-Ⅰ、 TPRⅠ、TPRⅡ、TGF-β1、Smad3等因子的高表达,同时促进该通路中发挥负性调控效应的Smad7达增加,证实了补阳还五汤能够发挥较好的抗肺纤维化作用与其调控TGF-β1/Smad信号通路有关。4.补阳还五汤调控肺纤维化TGF-β1/ERK通路机制研究建立肺纤维化大鼠模型,通过补阳还五汤干预后,采用Western blot法检测不同时间点各组大鼠肺组织TGF-β1、ERK1/2、p-ERK的表达,探讨补阳还五汤通过调控TGF-β1/ERK通路干预肺纤维化的作用机制。结果：①与假手术组相比,模型组大鼠肺组织TGF-β1、ERK1/2、p-ERK表达水平明显增高,差异有统计学意义(p<0.01)；②与模型组相比,各给药组TGF-β1、ERK1/2、p-ERK有不同程度的下降,差异明显(p<0.01or p<0.05)；③与强的松对照组相比,补阳还五汤中剂量组在第14d、28d,低剂量组在第28d时TGF-β1、ERK1/2、p-ERK的表达明显降低(p<0.05)。结论：补阳还五汤可以有效抑制病肺组织TGF-β1、ERK1/2、p-ERK表达上调,提示补阳还五汤能够较好的调控肺纤维化中TGF-β1介导的ERK通路,进而抑制其产生的促增殖作用。综上所述,本研究采用博莱霉素气管滴注经典造模方法制备大鼠肺纤维化模型,以TGF-β/Smad/ERK信号通路为切入点,采用现代分子生物学等研究技术和手段,从动物水平探讨补阳还五汤干预肺纤维化的可能作用机制。研究结果表明：补阳还五汤可以有效改善模型大鼠肺泡炎症及肺纤维化程度,降低血清PCⅢ、 Ⅳ-C、HA、LN含量,抑制TβRⅠ、TβRⅡ、Smad3、CollagenⅠ、TGF-β1mRNA、 Smad3mRNA、ERK1/2、p-ERK蛋白在病肺组织中的过度表达,促进Smad7以及Smad7mRNA的活性,提示补阳还五汤可以有效调控TGF-β1/Smad介导的致纤维化作用,以及TGF-β1/ERK通路介导的促增殖作用,进而起到抗纤维化的作用。

全文目录


中文摘要  2-6
Abstract  6-11
缩略词表  11-13
目录  13-16
前言  16-24
  1. 研究背景  16-21
    1.1 肺纤维化的流行病学研究  16
    1.2 TGF-β/Smad/ERK信号转导通路在肺纤维化形成中的重要作用  16-19
    1.3 中医药对肺纤维化的研究概况  19-21
  2. 研究思路  21-22
  3. 技术路线图  22-23
  4. 实验方案路线图  23-24
实验一 补阳还五汤对博莱霉素所致肺纤维化大鼠肺指数及肺组织形态学的影响  24-44
  一、实验材料  24-26
    1. 实验动物  24-25
    2. 实验药物  25
    3. 实验试剂  25
    4. 实验仪器  25-26
  二、实验方法  26-31
    1. 动物分组  26
    2. 模型制备  26-27
    3. 给药方法  27
    4. 标本采集及处理  27-28
    5. 检测指标与方法  28-30
    6. 统计分析  30-31
  三、实验结果  31-40
    1. 一般情况观察  31
    2. 肺指数变化情况  31-32
    3. 肺组织大体形态改变  32-33
    4. 肺组织病理形态学改变  33-36
    5. 肺组织病理形态学定量分析结果  36-40
  四、讨论  40-43
  五、小结  43-44
实验二 补阳还五汤对博莱霉素所致肺纤维化大鼠血清纤维化指标PCⅢ、Ⅳ-C、HA、LN含量的影响  44-54
  一、实验材料  44-45
    1. 实验动物  44
    2. 实验药物  44
    3. 实验试剂  44
    4. 实验仪器  44-45
  二、实验方法  45-46
    1. 动物分组  45
    2. 模型制备  45
    3. 给药方法  45
    4. 标本采集及处理  45
    5. 检测指标与方法  45
    6. 统计分析  45-46
  三、实验结果  46-51
    1. 血清Ⅲ型前胶原氨端肽(PCⅢ)检测结果  46-47
    2. 血清Ⅳ型胶原氨端肽(IV-C)检测结果  47-48
    3. 血清透明质酸(HA)检测结果  48-49
    4. 血清层粘连蛋白(LN)检测结果  49-51
  四、讨论  51-53
  五、小结  53-54
实验三 补阳还五汤调控肺纤维化TGF-β_1/Smad通路机制研究  54-79
  一、实验材料  54-55
    1. 实验动物  54
    2. 实验药物  54
    3. 实验试剂  54-55
    4. 实验仪器  55
  二、实验方法  55-62
    1. 动物分组  55-56
    2. 模型制备  56
    3. 给药方法  56
    4. 标本采集及处理  56
    5. 检测指标与方法  56-61
    6. 统计分析  61-62
  三、实验结果  62-72
    1. 肺组织Col-Ⅰ的表达情况  62-63
    2. 肺组织TβRⅠ的表达情况  63-64
    3. 肺组织TβRⅡ的表达情况  64-65
    4. 肺组织Smad3的表达情况  65-67
    5. 肺组织Smad7的表达情况  67-68
    6. 肺组织TGF-β_1 mRNA的表达情况  68-69
    7. 肺组织Smad3mRNA的表达情况  69-70
    8. 肺组织Smad7mRNA的表达情况  70-72
  四、讨论  72-78
  五、小结  78-79
实验四 补阳还五汤调控肺纤维化TGF-β_1/ERK通路机制研究  79-90
  一、实验材料  79-81
    1. 实验动物  79
    2. 实验药物  79
    3. 实验试剂  79-80
    4. 实验仪器  80-81
  二、实验方法  81-84
    1. 动物分组  81
    2. 模型制备  81
    3. 给药方法  81
    4. 标本采集及处理  81
    5. 检测指标与方法  81-84
    6. 统计分析  84
  三、实验结果  84-87
    1. 肺组织TGF-β_1的表达情况  84-85
    2. 肺组织ERK1/2的表达情况  85-86
    3. 肺组织p-ERK的表达情况  86-87
  四、讨论  87-88
  五、小结  88-90
结语  90-91
问题与展望  91-92
致谢  92-93
参考文献  93-104
附录  104-138
  综述一 肺纤维化的中医药研究进展  104-124
  综述二 益气活血法治疗肺纤维化研究进展  124-138
附图  138-150
在读期间公开发表的学术论文、著作及科研成果  150-151

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