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黄芪和葛根素注射液对糖尿病肾病内质网应激GRP78、ATF4、CHOP表达的影响

作　者: 聂彦娜
导　师: 王谦
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中西医结合基础
关键词: 糖尿病肾病 黄芪和葛根素注射液 内质网应激
分类号: R259
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


研究目的：糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)最终会导致慢性肾功能不全,严重影响糖尿病患者的生存质量,也是患者常见的最主要的致死原因之一。近年来,研究发现,内质网应激导致的细胞凋亡可能与DN的发生、发展有关。我们通过观察KKAy糖尿病小鼠形态学和血生化的改变,以及采用Western blot和RT-PCR的方法观察肾脏和人肾小管上皮细胞中内质网应激相关因子GRP78、ATF4、CHOP表达的情况及肾组织细胞凋亡变化,探索黄芪注射液和葛根素注射液联合用药对KAY小鼠糖尿病肾损伤的治疗作用,揭示黄芪注射液和葛根素注射液通过调节内质网应激反应防治DN的具体机制,为黄芪和葛根配伍治疗DN提供实验依据,为糖尿病肾病临床用药提供理论依据及新的作用靶点。研究方法：1、整体实验(1)高脂喂养KKAy小鼠造模,将造模成功的小鼠(尾尖取血测血糖,随机血糖>13.9mmo1/L)随机分为模型组和治疗组(治疗组腹腔注射黄芪注射液和葛根素注射液)。选取同龄C57BL/6J雄性小鼠作为对照组,各组小鼠分笼饲养。饲养至12周龄,治疗组小鼠开始腹腔注射两种注射液,模型组小鼠注射同等剂量的生理盐水。于16周龄处死各组小鼠,收集血清,检测生化指标如空腹血糖、血肌酐、尿素氮、血脂等指标。(2)取肾脏组织制作病理切片,HE染色观察肾组织病理形态变化。(3)TUNEL检测肾组织细胞凋亡情况。(4)用免疫组化的方法,检测各组小鼠肾组织中GRP78、ATF4、CHOP蛋白的表达情况。(5)用Real time PCR和Western blot的方法,检测各组小鼠肾组织中GRP78、ATF4、CHOP基因的表达情况。2、离体实验(1)实验分组：10%胎牛血清的DMEM培养基培养人肾小管上皮细胞HK-2细胞系,按以下要求分组：对照组：常规培养人肾小管上皮细胞HK-2细胞,含糖量：5.5mmol/L。模型组：高糖培养基培养HK-2细胞,含糖量：25mmol/L。治疗组：高糖+黄芪和葛根素注射液HK-2细胞,含糖量：25mmol/L。(2)48h后,用Real time PCR和Western blot方法,检测各组细胞中GRP78、ATF4、CHOP基因的表达。研究结果：1、整体实验(1)与对照组小鼠相比较,模型组小鼠空腹血糖(P<0.01)均较高,差异有统计学意义。血生化指标如尿酸(P<0.01)、尿素氮(P<0.01)和血脂(P<0.01)等均显著升高。经黄芪、葛根素注射液联合用药后,治疗组空腹血糖(P<0.01)、尿酸(P<0.01)、尿素氮(P<0.01)较模型组均显著降低,其中,治疗组空腹血糖与模型组比较,虽有统计学差异,但尚未达到正常水平。(2)小鼠肾组织HE染色光镜观察可见对照组小鼠肾脏肾小管、肾小球结构完整清晰,无间质纤维化；16周龄KKAy模型组小鼠可见肾小管上皮细胞胞浆出现少量空泡,肾小球系膜基质略有增多,发生了糖尿病肾病的早期病理改变。经治疗后,治疗组肾小球、肾小管结构完整、清楚,可见少量空泡,病变不明显。(3)TUNEL实验结果表明模型组肾脏组织存在细胞凋亡的情况,经药物治疗后凋亡程度降低。(4)16周龄模型组KKAy小鼠肾组织中,内质网应激通路中的指标GRP78、ATF4、 CHOP基因表达异常,经治疗后,在mRNA水平GRP78(P<0.05)、ATF4(P<0.05)、CHOP(P<0.05)和蛋白水平GRP78(P<0.01)、ATF4(P<0.05)、CHOP(P<0.05)表达量均下调下调,与模型组相比差异具有统计学意义。免疫组化的实验结果与上述结果一致。2、离体实验(1)人肾小管上皮细胞GRP78、ATF4、CHOP基因的表达量均有异常,与对照组相比表达量明显升高；经治疗后mRNA水平GRP78(P<0.01)、ATF4(P<0.01)、CHOP(P<0.01)和蛋白水平GRP78(P<0.01)、ATF4(P<0.01)、CHOP(P<0.01)的表达量有所降低,与模型组相比,差异具有统计学意义。研究结论：(1)黄芪注射液与葛根素注射液联合治疗,有降低血糖和血脂、改善肾功能、减轻肾脏病理学改变,减轻细胞过度凋亡的作用。(2)16周龄KKAy小鼠肾功能损害明显,ERS被激活,ERS诱导的细胞凋亡发生,黄芪注射液联合葛根素注射液治疗,对内质网应激具有抑制作用,可通过调节内质网应激相关因子GRP78、ATF4、CHOP基因的表达发挥治疗糖尿病肾病的作用。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-9
英文缩略词  9-11
综述：内质网应激及其诱导的凋亡与糖尿病肾病的研究进展  11-24
  参考文献  19-24
实验研究  24-52
  (一) 整体实验  24-44
    前言  24-26
    实验一：黄芪注射液和葛根素注射液对小鼠肾病的治疗作用  26-34
      1 实验材料  26-27
      2 实验方法  27-29
      3 实验结果  29-34
    实验二：黄芪注射液和葛根素液对KKA~Y小鼠肾组织GRP78、ATF4、CHOP表达的影响  34-44
      1 实验材料  34-36
      2 实验方法  36-40
      3 实验结果  40-44
  (二) 离体实验  44-52
    前言  44-45
    实验一：黄芪和葛根素注射液对高糖刺激的HK-2细胞GRP78、ATF4、CHOP表达的影响  45-52
      1 实验材料  45-46
      2 实验方法  46-50
      3 实验结果  50-52
讨论  52-57
参考文献  57-60
结论  60-61
致谢  61-62
个人简历  62

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