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双酚A对离体海马神经元突触形态可塑性的影响

作　者: 张广侠
导　师: 徐晓虹
学　校: 浙江师范大学
专　业: 生态学
关键词: 双酚A F-actin 树突棘 PSD-95 Synapsin Ⅰ 雌激素受体 ERK1/2
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

双酚A (bisphenol A, BPA),是一种广泛用于塑料生产的环境内分泌干扰物。BPA可以模拟天然激素作用,干扰内分泌系统正常功能。由于含有BPA的生活用品的普遍使用,BPA在人类的高暴露率引起人们的高度关注。近二十年来越来越多的研究表明,低剂量的BPA可以干扰雌激素和雄激素活性,对脑发育产生不利影响,导致许多生理和心理上的异常。本实验室前期研究发现,围生期BPA暴露影响子代小鼠的多种社会行为及其性别分化；青春期至成年早期BPA暴露负性调节海马突触界面结构修饰、下调突触蛋白PSD-95表达,并减退学习记忆功能；但在体急性暴露却促进大鼠的被动回避短时记忆,进一步体外研究发现,BPA急性暴露可增加离体培养海马神经元的树突丝密度及树突分支总长并促进树突丝运动性。因此推测BPA急慢性暴露对神经元结构和功能的影响可能不同。突触可塑性是指突触在一定条件下改变形态、增减数目和调整功能的能力,包括突触传递效能和突触形态结构的变化,其形态结构改变主要表现在树突棘上,而树突棘的发育又和肌动蛋白细胞骨架的重构密切相关,肌动蛋白的聚合和／或解聚的动态变化是树突棘生长、运动和形态改变的基础,随着对突触研究的进一步深入,越来越多的研究表明肌动蛋白细胞骨架在突触形态可塑性中发挥重要作用。PSD-95(post synaptic density protein95)是突触后致密体(PSD)上具有代表性的脚手架蛋白,可对信号转导分子进行整合从而调节突触活动；Synapsin Ⅰ位于突触前膜,通过磷酸化(p-synapsin Ⅰ)(?)口非磷酸化作用参与调控Ca2+/钙调素依赖性神经递质的释放,从而参与神经元之间的信息的传递,它既是突触发生的标志,又能反应突触的传递效能。鉴于此,本实验研究慢性BPA暴露对海马神经元突触形态可塑性的影响,同时应用雌激素受体拮抗剂、受体拮抗剂和MEK1/2抑制剂探索慢性BPA暴露影响突触形态可塑性的可能机制。方法：取出生24h内的SD大鼠做原代海马神经元培养,体外培养第四天(4DIV)加入药物,实验设立对照组(DMSO)、BPA各剂量组(10、100nM),暴露时间为6d。在10DIV时,采用免疫荧光染色法,用纤维型肌动蛋白(F-actin)特异性结合蛋白鬼笔环肽(罗丹明标记)染色离体培养海马神经元,显示神经元细胞骨架,激光共聚焦扫描显微镜下观察BPA慢性暴露对海马神经元形态的影响,并检测树突丝及树突棘中F-actin的表达。接着,为了探究BPA慢性暴露对突触形态的影响,我们采用细胞免疫双荧光染色法分别标记突触前、后蛋白(synapsin I和PSD-95),检测BPA对synapsin I和PSD-95的表达的影响；并由synapsin I(绿色荧光)和PSD-95(红色荧光)共表达区域定位突触(黄色荧光),计算突触密度。由Meta Morph7.7软件分析采集的荧光图片。为进一步分析BPA影响突触形态可塑性的分子机制,采用Western Bloting法检测p-ERK蛋白表达水平的变化；并在BPA处理前,先用雌激素受体阻断剂(ICI182,780)、NMDA受体阻断剂(MK801)和MEK1/2阻断剂(U0126)预处理,以期探究雌激素受体、NMDA受体及ERK信号通路是否参与了慢性BPA暴露对海马神经元的影响。结果：1.BPA(10nM)慢性暴露6天,显著降低海马神经元树突丝密度及长度(P<0.05),该作用可被雌激素受体阻断剂ICI182,780及MEK1/2阻断剂U0126抑制(P<0.01或P<0.05)；BPA(10～100nM)慢性暴露6天,显著降低树突棘密度和总突起密度(P<0.05或P<0.01),该作用可被雌激素受体阻断剂ICI182,780及NMDA受体阻断剂MK801抑制(P<0.05或P<0.01)。2.BPA(10～100nM)慢性暴露6天,对树突丝上的F-actin表达无显著影响,但显著下调海马神经元树突棘中F-actin的表达(P<0.05或P<0.01),这种下调作用可被雌激素受体阻断剂ICI182,780、NMDA受体阻断剂MK801及MEK1/2阻断剂U0126抑制(P<0.01或P<0.05)。3.BPA(10～100nM)慢性暴露6天,显著抑制突触上synapsin I和PSD-95的表达(P<0.05或P<0.01),10nM BPA还降低突触密度(P<0.01),此作用可被雌激素受体阻断剂ICI182,780及MEK1/2阻断剂U0126所抑制(P<0.05或P<0.01)。4.BPA(10-100nnM)慢性暴露6天,显著下调p-ERK蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)。结论：与急性BPA暴露促进树突丝发育不同,慢性BPA暴露抑制离体海马神经元树突丝及树突棘发育,并抑制突触发生。BPA的这种抑制作用可能是由雌激素受体介导,通过ERK信号途径引起肌动蛋白细胞骨架的重塑从而导致神经元树突形态发生变化并对突触发生产生影响。BPA对树突发育及突触发生的抑制作用可能是在体实验中BPA慢性暴露引起多种行为变化及记忆的损伤的原因之

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-13
符号说明  13-15
第一章绪论  15-25
  1 BPA概述  15-16
  2 BPA与脑发育  16-18
  3 树突棘与突触可塑性  18-21
  4 雌激素与突触可塑性  21-23
  5 本研究的目的和意义  23-25
第二章 BPA对海马神经元形态发育的影响  25-36
  1 引言  25
  2 材料与方法  25-28
  3 结果  28-33
  4 讨论  33-36
第三章 BPA对海马神经元树突F-actin表达的影响  36-42
  1 引言  36
  2 材料与方法  36-37
  3 结果  37-39
  4 讨论  39-42
第四章 BPA对海马神经元突触密度及synapsinI和PSD-95表达的影响  42-52
  1 引言  42
  2 材料与方法  42-45
  3 结果  45-50
  4 讨论  50-52
第五章 BPA对海马神经元ERK磷酸化水平的的影响  52-57
  1 引言  52
  2 材料与方法  52-55
  3 结果  55
  4 讨论  55-57
第六章结论  57-58
参考文献  58-72
致谢  72-73
攻读学位论文期间发表的学术论文目录  73-74

双酚A对离体海马神经元突触形态可塑性的影响

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