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对虾白斑综合征病毒（WSSV）VP12、VP14、VP51、VP136C与病毒及宿主蛋白的相互作用

作　者: 马方方
导　师: 刘庆慧
学　校: 上海海洋大学
专　业: 水生生物学
关键词: 对虾白斑综合征病毒 VP12 VP14 VP51 VP136C LvANT LvAK LvRPL7 作用
分类号: S945.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


对虾白斑综合征病毒（WSSV）是对虾重要的致病原，从开始发病的2到5天内会导致对虾100%的死亡率。病毒的结构蛋白在靶定细胞、病毒入侵、组装、复制和引起宿主抗病毒反应的过程中起重要作用，因此分析病毒蛋白的功能对于了解WSSV的侵染机制和致病机理，寻找有效防止WSSV的感染方法具有重要作用。研究内容及结果如下：第一部分：VP12是囊膜蛋白,对应中国株ORF432,编码102氨基酸，理论分子量为12kDa。根据GeneBank上WSSV囊膜蛋白基因vp12（wsv432）的序列，设计并合成引物，PCR扩增得到vp12基因，构建重组表达载体pBAD/gIIIA–vp12并转化大肠杆菌Top10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖诱导，表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小19kDa相符合的目的蛋白。以Co2+亲和层析方法，获得纯化VP12蛋白，制备兔抗VP12的抗体。提取感染WSSV不同时刻的对虾鳃组织的RNA，利用RT-PCR技术分析发现VP12是感染早期表达的基因。用FITC标记的VP12与对虾血淋巴细胞作用，结果表明VP12能够粘附到细胞表面。用地高辛标记VP12，采用Far-western blot、ELISA，分析VP12与WSSV结构蛋白的作用，结果表明，VP12与囊膜蛋白VP24、VP26具有相互作用；分析VP12与对虾鳃细胞膜蛋白的作用，筛选出一个鳃膜蛋白与VP12具有结合作用，经质谱分析为腺嘌呤核苷转移酶（LvANT）.第二部分：用已有的重组菌株，37℃用L-阿拉伯糖诱导，以Co2+亲和层析方法，获得纯化LvANT蛋白，制备兔抗LvANT的抗体。Far-western blot、ELISA分析表明重组的VP12和LvANT具有结合作用。间接免疫荧光结果表明VP12与LvANT共定位于细胞表面; RT-PCR分析表明，LvANT在对虾血淋巴、鳃组织、肌肉、类淋巴、肝胰腺、胃、肠组织中都有表达；细胞定位实验表明LvANT主要定位在血细胞的表面和细胞质内；体外中和试验发现，LvANT在感染的早期能够延迟WSSV的侵染。第三部分：根据GeneBank上WSSV囊膜蛋白基因vp14的序列，设计并合成引物，PCR扩增得到vp14基因，构建重组表达载体pBAD/gIIIA–vp14并转化大肠杆菌Top10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖诱导，表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小15kDa相符合的目的蛋白。以Co2+亲和层析方法，获得纯化VP14蛋白，制备鼠抗VP14的抗体。间接免疫荧光试验表明VP14能够粘附到对虾血细胞表面。质谱分析显示VP14与VP26,VP28有结合作用；采用Far-western blot证明VP14与VP26、VP28C、VP37和VP39具有结合作用。将VP14与对虾鳃细胞膜蛋白作用，筛选出一个鳃膜蛋白，经质谱分析为精氨酸激酶（LvAK）。第四部分：根据GeneBank上WSSV囊膜蛋白基因LvAK序列，设计并合成引物，PCR扩增得到LvAK基因，构建重组表达载体pBAD/gIIIA–AK并转化大肠杆菌Top10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖诱导，表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小45kDa相符合的目的蛋白。以Co2+亲和层析方法，获得纯化LvAK蛋白，制备兔抗LvAK的抗体。Far-western blot、ELISA进一步表明重组的LvAK和VP14具有结合作用，间接免疫荧光结果表明VP14与LvAK共定位于细胞表面；转录分析表明，LvAK在对虾血淋巴、鳃组织、肌肉、类淋巴、肝胰腺和肠中都有分布，在肌肉中的表达量最大；细胞定位实验表明LvAK主要定位在血细胞的表面和细胞质内，细胞核内几乎没有；Real-time PCR分析表明，当对虾受到WSSV攻击时，血淋巴、肌肉中的LvAK的表达量会迅速发生变化，表明LvAK与WSSV感染密切相关。第五部分：根据GeneBank上WSSV囊膜蛋白基因vp51的序列，设计并合成引物，PCR扩增得到vp51基因，构建重组表达载体pBAD/gIIIA–vp51并转化大肠杆菌Top10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖诱导，表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小55kDa相符合的目的蛋白。以Co2+亲和层析方法，获得纯化VP51蛋白。Far-western blot实验表明VP51与对虾鳃膜蛋白的LvANT、LvRPL7有作用。第六部分：根据GeneBank上公布的LvRPL7的序列，设计并合成引物，PCR扩增得到LvRPL7基因，构建重组表达载体pBAD/gIIIA–RPL7并转化大肠杆菌Top10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖诱导，表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小37kDa相符合的目的蛋白。以Co2+亲和层析方法，获得纯化LvRPL7蛋白,制备兔抗LvRPL7的抗体。Far-western blot、ELISA分析进一步表明重组的LvRPL7和VP51具有结合作用。RT-PCR分析显示，LvRPL7的mRNA在对虾血淋巴、鳃组织、肌肉、类淋巴、肝胰腺和肠中都有转录表达，在肌肉中的表达量最大，其次是鳃组织；细胞定位实验表明LvRPL7主要定位在血细胞的表面和细胞质内，细胞核内几乎没有；Real-time PCR分析表明，当对虾受到WSSV攻击时，肌肉和肝胰腺中的LvRPL7的表达量会迅速发生变化，表明LvRPL7与WSSV感染密切相关。第七部分：VP136是WSSV核衣壳蛋白, VP136C是VP136C-端含RGD序列的部分片断，编码373个氨基酸，理论分子量为40KD。根据GeneBank上WSSV囊膜蛋白基因vp136C的序列，设计并合成引物，PCR扩增得到vp136C基因，构建重组表达载体pBAD/gIIIA–vp136C并转化大肠杆菌Top10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖诱导，表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小45kDa相符合的目的蛋白。以Co2+亲和层析方法，获得纯化VP136C蛋白。用FITC标记的VP136C与对虾血淋巴细胞作用，VP136C能够粘附到细胞表面。采用Far-western blot、ELISA方法，分析VP136C与WSSV结构蛋白的作用，结果表明，VP136C与囊膜蛋白VP26具有相互作用；分析VP136C与对虾鳃细胞膜蛋白的作用，发现VP136C能与血蓝蛋白、肌动蛋白、LvANT和F0-ATP synthaseb链结合。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-13
引言  13-19
第一章 VP12 的原核表达及功能分析  19-41
  第一节 VP12 的重组表达  19-28
    1.实验材料与方法  19-25
    2.实验结果  25-28
  第二节 VP12 与对虾血淋巴细胞的作用及中和试验  28-33
    1.实验方法  28-31
    2.实验结果  31-33
  第三节 VP12 与 WSSV 几种结构蛋白之间的作用  33-38
    1.试验方法  33-34
    2.实验结果  34-38
  第四节 VP12 与凡纳滨对虾鳃膜蛋白之间的作用  38-41
    1.试验方法  38
    2.实验结果  38-40
    3.讨论  40-41
第二章 凡纳滨对虾 LvANT 的表达及与 WSSV 作用  41-51
  第一节凡纳滨对虾 LvANT 的原核表达及抗体制备  41-45
    1.实验材料与方法  41-43
    2.实验结果  43-45
  第二节 ANT 的组织分布及与 VP12 的相互作用  45-51
    1.实验材料与方法  45-46
    2.实验结果  46-50
    3.讨论  50-51
第三章 VP14 的原核表达及功能分析  51-61
  第一节 VP14 的重组表达与抗体制备  51-55
    1.实验材料与方法  51-52
    2.实验结果  52-55
  第二节 VP14 与 WSSV 结构蛋白及对虾鳃细胞膜蛋白的相互作用  55-61
    1.试验方法  55-56
    2.实验结果  56-60
    3.讨论  60-61
第四章 凡纳滨对虾 AK 的表达及与 WSSV 作用  61-74
  第一节 凡纳滨对虾 AK 的原核表达与抗体制备  61-65
    1 实验材料和试验方法  61-62
    2.实验结果  62-65
  第二节 AK 与 WSSV 蛋白作用  65-69
    1 实验材料和试验方法  65-66
    2.实验结果  66-69
  第三节 AK 组织分布及 WSSV 感染对 AK mRNA 表达量的影响  69-74
    1 实验材料和试验方法  69-71
    2.实验结果  71-73
    3.讨论  73-74
第五章 VP51 的原核表达及功能分析  74-81
  第一节 VP51 的重组表达  74-78
    1.实验材料与方法  74-75
    2.实验结果  75-78
  第二节 VP51 与对虾鳃细胞膜蛋白的相互作用  78-81
    1.试验方法  78
    2.实验结果  78-80
    3.讨论  80-81
第六章 凡纳滨对虾 RPL7 的表达及与 WSSV 作用  81-94
  第一节 凡纳滨对虾 RPL7 的原核表达与抗体制备  81-88
    1 实验材料和试验方法  81-83
    2.实验结果  83-88
  第二节 RPL7 组织分布及 WSSV 感染对 RPL7 mRNA 表达量的影响  88-94
    1.实验材料和试验方法  88-90
    2.实验结果  90-93
    3.讨论  93-94
第七章 VP136C 的原核表达及功能分析  94-107
  第一节 VP136C 的原核表达  94-98
    1.实验材料与方法  94-95
    2.实验结果  95-98
  第二节 VP136C 与 WSSV 结构蛋白及对虾鳃膜蛋白间的作用  98-107
    1.试验方法  98-100
    2.实验结果  100-106
    3.讨论  106-107
小结  107-108
参考文献  108-116
附录  116-119
致谢  119

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治 > 虾类
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