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垂盆草提取物对草鱼脂肪肝模型药效作用研究

作　者: 吴春艳
导　师: 汪开毓
学　校: 四川农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 垂盆草草鱼脂肪肝病理观察生化指标 SREBP-1 CPT-1 PPAR-α TNF-α
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

试验一建立草鱼脂肪肝模型试验对体重12±1.5g的健康草鱼分成基础组和高脂组,分别投喂可维持草鱼正常生理代谢的脂肪含量4.6%(鱼油2.8%+大豆油1.8%)的基础饲料和过量脂肪含量8.1%(鱼油5%+大豆油3.1%)的高脂饲料,进行连续6周的投喂。并在试验的第2、4、6周随机抽取基础组和高脂组草鱼各6尾,采集血清、观察内脏器官变化及采集肝胰脏组织样本,检测可反映草鱼肝胰脏损伤程度的主要生理生化指标,并利用H.E和苏丹染色技术观察判断由高脂饮食引起的草鱼肝胰脏损伤程度,对两组草鱼肝胰脏进行脂肪肝模型的判定。结果显示：试验期间基础组草鱼血清、肝胰脏组织生理生化指标及组织病理学观察均未发现病理变化。试验期间高脂组草鱼血清生理生化指标检测结果显示：谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(CHO)水平随着试验时间的延长而显著升高(P<0.01),说明草鱼肝细胞出现了的损伤,并且由于过量的高脂饮食,导致血清TG和CHO含量增高,说明草鱼肝胰脏积累了过量的脂质；肝胰脏组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平随着试验时间的延长,也呈现出显著上升的趋势(P<0.01),说明过量的高脂饮食导致体内过氧化反应加剧,肝胰脏受到严重的损伤。组织病理学观察结果显示：高脂组草鱼肝胰脏在试验进行到第4周已发现肝细胞脂滴积累严重,到试验第6周结束时肝细胞已经发生了严重的脂肪变性。综合以上高脂组草鱼血清、肝胰脏生理生化指标的变化及病理组织学观察结果,可认为本次试验利用连续6周投喂8.1%高脂饲料的方法,成功复制了草鱼脂肪肝模型。试验二垂盆草提取物对草鱼脂肪肝药效观察利用试验一方法成功建立草鱼脂肪肝模型,将模型草鱼平均分为5组,分别为高脂组(脂肪含量8.1%的高脂饲料)、垂盆草高剂量组(脂肪含量8.1%的高脂饲料+1.2g·kg-1垂盆草提取物)、垂盆草中剂量组(脂肪含量8.1%的高脂饲料+0.6g·kg-1垂盆草提取物)、垂盆草低剂量组(脂肪含量8.1%的高脂饲料+0.3g·kg-1垂盆草提取物)及治疗对照组(脂肪含量8.1%的高脂饲料+0.02g·kg-1脂必妥),另外利用健康草鱼作为基础组(投喂脂肪含量4.6%的基础饲料)。每日的9：00am、12：00am和6：00pm,进行连续6周的投喂。并在投喂加药饲料后的第2、4、6周随机抽取各组草鱼6尾,采集血清、观察内脏器官变化同时采集肝胰脏组织样本,检测治疗6周内可反映草鱼肝胰脏损伤程度的主要生理生化指标,并利用H.E和苏丹染色技术观察肝胰脏脂滴减少程度,判断垂盆草提取物对持续投喂高脂饲料造成的草鱼脂肪肝疾病的治疗效果。血清及肝胰脏组织生化指标结果显示：试验期间相对于高脂组草鱼,垂盆草高、中和低剂量组均显著降低了患有脂肪肝草鱼血清ALT和ALT水平(P<0.01),并抑制了高脂饲料造成血清TG和CHO水平的升高,降低了草鱼肝胰脏MDA含量,并提高了SOD、CAT活性。说明垂盆草提取物可有效缓解草鱼肝胰脏损伤,降低血脂水平,提升了肝胰脏的抗氧化能力。组织病理学观察结果显示：垂盆草提取物可改善由于持续的高脂饮食引起的草鱼肝细胞脂肪变性,说明了垂盆草提取物可促进肝细胞内脂质代谢。综合以上各组草鱼血清和肝胰脏生理生化指标的变化及病理组织学观察结果,垂盆草高剂量组综合治疗效果最好,总结出垂盆草提取物可显著治疗由于连续投喂高脂饲料引起的草鱼脂肪肝疾病。试验三草鱼肝胰脏SREBP-1、CPT-1、PPAR-α和TNF-α mRNA表达的半定量检测选取试验二基础组、高脂组及治疗6周后垂盆草高剂量组与垂盆草低剂量组的草鱼肝胰脏组织,利用Trizol法提取草鱼肝胰脏组织总RNA,使用特异性引物两步法RT-PCR扩增出目的基因,并利用半定量方法检测各组草鱼肝胰脏SREBP-1、 CPT-1、 PPAR-α和TNF-α mRNA的相对表达量。用药6周后结果显示：垂盆草高剂量组可显著提高肝胰脏CPT-1mRNA和PPAR-α mRNA相对表达量(P<0.01),并显著抑制脂肪肝引起的SREBP-1和TNF-α mRNA的相对表达量的升高(P<0.01)。说明垂盆草提取物可通过提高肝胰脏CPT-1和PPAR-α活性,降低SREBP-1和TNF-α活性,进而达到对草鱼脂肪肝的保护作用。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-13
第一章文献综述  13-23
  1 鱼类脂肪肝的概况  13
  2 鱼类肝脏对脂肪的代谢  13-17
    2.1 鱼类肝脏对脂肪的代谢与调控  13-14
    2.2 固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)  14-15
    2.3 过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α)  15
    2.4 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)  15-16
    2.5 肉碱棕榈酰转移酶I(CPT-1)  16-17
  3 动物肝损伤模型建立方法  17-19
    3.1 药物中毒性肝损伤模型  17-18
    3.2 酒精性肝损伤模型  18
    3.3 营养代谢性肝损伤模型  18-19
  4 垂盆草研究进展  19-22
    4.1 垂盆草分类地位与生长性状  19-20
    4.2 化学成分  20
    4.3 药用价值  20-22
  5 试验目的与意义  22-23
第二章草鱼脂肪肝模型的建立  23-38
  1 试验材料  23
    1.1 试验动物  23
    1.2 饲料原料  23
    1.3 主要试剂  23
    1.4 主要仪器  23
  2 试验方法  23-27
    2.1 草鱼脂肪肝模型建立  23-25
    2.2 试验动物样品采集  25-26
    2.3 造模过程中草鱼生化指标的动态观察  26-27
    2.4 统计分析  27
    2.5 模型判定标准  27
  3 试验结果  27-35
    3.1 剖检变化  27-28
    3.2 生长性能变化  28-29
    3.3 造模结果判定  29-31
    3.4 造模期间草鱼各项生理指标的变化  31-35
  4 讨论  35-37
    4.1 高脂饲料对草鱼生长性能及组织病理学观察  35-36
    4.2 高脂饲料对血清指标的影响  36
    4.3 高脂饲料对血脂含量的影响  36
    4.4 高脂饲料对肝胰脏抗氧化能力的影响  36-37
  5 小结  37-38
第三章垂盆草对草鱼脂肪肝模型治疗作用研究  38-57
  1 试验材料  38
    1.1 试验动物  38
    1.2 饲料原料  38
    1.3 药品和试剂  38
    1.4 主要仪器  38
  2 试验方法  38-41
    2.1 试验分组和给药方法  38-39
    2.2 饲料设计与制作方法  39-40
    2.3 样品采集  40
    2.4 H.E染色  40
    2.5 血清及肝胰脏生化指标的测定  40-41
    2.6 统计分析  41
  3 试验结果  41-54
    3.1 治疗6周后草鱼生长性能变化  41-42
    3.2 H.E染色观察结果  42-46
    3.3 生理生化指标检测结果  46-51
    3.4 试验期间各指标平均值的组间比较  51-54
  4 讨论  54-56
    4.1 垂盆草对肝组织损伤的保护作用  54-55
    4.2 垂盆草对血脂含量的影响  55
    4.3 垂盆草对肝胰脏抗氧化能力的影响  55-56
  5 小结  56-57
第四章草鱼肝脏SREBP-1、CPT-1、PPAR-A、TNF-A基因MRNA表达的观察  57-64
  1 实验材料  57
    1.1 动物材料  57
    1.2 试剂  57
    1.3 试验器材  57
  2 试验方法  57-59
    2.1 试验器材的处理  57
    2.2 引物设计  57-58
    2.3 总RNA的提取  58
    2.4 总RNA纯度检测  58
    2.5 总RNA反转录cDNA  58-59
    2.6 退火温度与循环数的确定  59
    2.7 PCR扩增  59
    2.8 产物半定量分析  59
  3 结果  59-61
    3.1 总RNA的纯度  59-60
    3.2 SREBP-1、PPAR-α、TNF-α与CPT-1相对表达结果  60-61
  4 讨论  61-63
    4.1 半定量RT-PCR技术  61-62
    4.2 垂盆草对SREBP-1、PPAR-α、TNF-α与CPT-1的调控  62-63
  5 小结  63-64
第五章结论与创新  64-65
  1 结论  64
  2 试验创新点  64-65
参考文献  65-72
致谢  72

垂盆草提取物对草鱼脂肪肝模型药效作用研究

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