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海参cDNA文库的构建和序列分析以及组织蛋白酶L基因的克隆

作　者: 徐赛涛
导　师: 丛丽娜
学　校: 大连工业大学
专　业: 发酵工程
关键词: cDNA文库 刺参 组织蛋白酶L相关蛋白 组织蛋白酶L RT-PCR 测序分析
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


应用Gubler-Hoffman cDNA Library Construction技术，构建仿刺参cDNA文库。测试结果表明，库容量为2.010~6pfu/ml，利用PCR方法检测cDNA文库插入DNA片段的大小，其长度范围在0.5-4.1kb，插入片段平均长度为1.3kb，表明该文库达到建库要求，可用来筛选低丰度mRNA的基因克隆。随机挑选100个1kb以上的cDNA克隆进行测序分析，发现有26条EST序列和网上公布其它物种的序列相似性较高，这些基因与刺参能量代谢和蛋白水解相关。其中发现的几个重要基因，如编码遍在蛋白以及缬酪肽蛋白和组织酶L相关蛋白等，可能与仿刺参自溶过程的蛋白酶水解和细胞凋亡事件相关。另有74条EST序列相似性较低，推测可能是功能未知的新基因。组织蛋白酶L是一种嗜酸性溶酶体蛋白水解酶，广泛存在于人体各种正常组织细胞和肿瘤细胞中，它不仅参与生物体内各种蛋白水解，还参与许多重要的生命活动，如抗原呈递、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等。研究表明，组织蛋白酶L和组织蛋白酶L相关蛋白是同一蛋白的不同亚基，组织蛋白酶L相关蛋白和组织蛋白酶L以对接形式存在，组织蛋白酶L相关蛋白对组织蛋白酶L的靶向作用和表达及其活性起着重要的作用。通过对刺参cDNA文库的部分筛选和序列分析，我们发现了一条组织蛋白酶L相关蛋白基因(GenBank：EU306878)。全长cDNA为1335bp,5’非编码区(UTR)91bp，3’UTR489b，开放阅读框长度756bp，编码251个氨基酸。为此我们提取刺参总RNA，通过RT-PCR和RACE PCR技术，从刺参(Stichopus japonicus)体壁中克隆得到全长的组织蛋白酶L基因(GenBank：EU143709)。其中全长cDNA1129bp，5’非编码区（UTR）202bp，3’UTR87bp，开放阅读框999bp，编码332个氨基酸（aa），包括成熟肽316aa和信号肽16aa。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章 文献综述  10-22
  1.1 刺参简介和功效  10
  1.2 基因文库  10-14
    1.2.1 构建基因文库的方法和进展  10-13
    1.2.2 cDNA 文库的应用  13
    1.2.3 cDNA 文库技术的局限性  13-14
  1.3 EST 技术及其应用  14
  1.4 组织蛋白酶  14-20
    1.4.1 组织蛋白酶简介  14-15
    1.4.2 组织蛋白酶结构  15-16
    1.4.3 组织蛋白酶的功能  16
    1.4.4 组织蛋白酶 L  16-19
    1.4.5 组织蛋白酶 L 相关蛋白  19-20
  1.5 研究意义  20
  1.6 本文采用的技术路线如下  20-21
  1.7 研究手段  21-22
第二章 实验材料与方法  22-45
  2.1 实验材料  22-25
    2.1.1 实验原料  22
    2.1.2 实验仪器  22
    2.1.3 实验主要试剂  22-24
    2.1.4 生物信息学分析的主要软件与数据库  24-25
  2.2 实验方法  25-45
    2.2.1 文库构建以及文库筛选和序列分析  25-31
    2.2.2 CL 基因的分离  31-45
第三章 实验结果和讨论  45-66
  3.1 仿刺参 cDNA 文库构建、EST 序列分析  45-49
    3.1.1 仿刺参总 RNA 提取  45
    3.1.2 mRNA 的提取  45-46
    3.1.3 cDNA 文库质量检测  46
    3.1.4 仿刺参 cDNA 的序列测定和分析  46-49
  3.2 组织蛋白酶 L 基因的筛选分析  49-59
    3.2.1 CL 基因片段的分离  49-55
    3.2.2 3'RACE 末端扩增  55-57
    3.2.3 5'RACE 末端扩增  57-59
  3.3 CLAP 和 CL 基因的生物信息学分析  59-66
    3.3.1 刺参 CLAP cDNA 全长序列的特征分析  59-61
    3.3.2 刺参 CL cDNA 全长序列的特征分析  61-66
第四章 结论  66-67
参考文献  67-70
致谢  70

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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