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鸭疫里氏杆菌的分子诊断及抗药性研究

作　者: 谭秋杉
导　师: 张先福
学　校: 浙江农林大学
专　业: 森林保护学
关键词: 鸭疫里氏杆菌分子诊断 16S rRNA 抗药性黄连汤
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 27次
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内容摘要

鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)是鸭传染性浆膜炎的病原菌，主要侵染2～8周龄雏鸭，对养鸭业危害十分严重。RA有21个血清型，各血清型之间缺乏交叉保护能力。目前，对RA的防控主要依靠抗生素，但RA对抗生素易产生耐药性，临床防治效果不佳。对RA的诊断主要依靠血清学诊断，费时费力。鉴于此，本论文建立了用分子生物学技术快速确诊RA的方法，并采用纸片扩散法检测RA对抗菌药物的敏感性，旨在为快速诊断和临床防治RA病提供科学依据。经对浙江省临安市横畈麻鸭养殖场发病雏鸭致病菌进行分离培养、生理生化鉴定，获得14株符合RA生物学特性的分离株。基于RA的16S rRNA基因保守序列设计引物，建立PCR法对RA进行诊断。结果6株标准株RA、14株临床分离疑似RA能扩增出698bp的特异性条带，而鸭大肠杆菌(Escherichia coli)和鸭沙门氏菌(Salmonella)未能扩增出特异性条带。测序结果分析显示，与NCBI上RA菌株相应片段相似性达99.9%。利用这对引物以RA不同稀释度菌液为模板进行PCR敏感度检测，最小检出量为2.3×10~3CFU/mL。用该法对鸭场随机送检的10只病死鸭组织(肝脏、脑、心血、脾、肠、肌肉)的诊断研究发现：脑组织中RA检出率最高，其次为心血、肝脏和脾，肠和肌肉未检出。PCR法的检出率为90%，细菌分离鉴定检出率为70%， PCR法检出率比细菌分离鉴定检出率高20%。研究结果表明：基于16S rRNA基因序列的PCR检测方法在RA诊断中具有特异、灵敏和快速的优点。使用9种常用抗生素和中药黄连汤(由黄连、黄柏、甘草组成的复方汤剂)，以纸片扩散法对RA进行抑菌试验，发现RA对黄连汤、诺氟沙星和氯霉素高度敏感，其敏感度相对应的为100%、95%和90%；对头孢拉定、新霉素和四环素中度敏感，中度敏感率分别为90%、85%和80%；对卡那霉素、链霉素、庆大霉素、氨苄西林耐药性很强，其耐药率相应为100%、85%、80%和65%。建议临床防治RA病时，宜首先采用中药，不仅防治效果良好，还能减少细菌耐药性发生，降低抗生素使用量，提高鸭产品品质。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-11
第一章鸭疫里氏杆菌的研究进展  11-27
  1.1 鸭疫里氏杆菌病原学研究进展  11-17
    1.1.1 鸭疫里氏杆菌的命名和分类  11-12
    1.1.2 鸭疫里氏杆菌的生物学特性  12-13
    1.1.3 鸭疫里氏杆菌的血清型  13-14
    1.1.4 鸭疫里氏杆菌的毒力相关因子  14-15
    1.1.5 流行病学研究进展  15-16
    1.1.6 临床症状与病理变化研究进展  16-17
      1.1.6.1 临床症状  16
      1.1.6.2 病理学变化特征  16-17
  1.3 鸭疫里氏杆菌的检测与诊断方法研究进展  17-19
    1.3.1 临床诊断  17
    1.3.2 实验室诊断  17-19
      1.3.2.1 细菌学鉴定  17
      1.3.2.2 凝集试验与琼脂扩散试验  17-18
      1.3.2.3 荧光抗体技术  18
      1.3.2.4 间接血凝试验  18
      1.3.2.5 ELISA 试验  18
      1.3.2.6 间接免疫酶组织化学法  18-19
      1.3.2.7 聚合酶链式反应(PCR)快速检测法  19
  1.4 鸭疫里氏杆菌病的防治研究进展  19-23
    1.4.1 药物防治的研究进展  19-20
      1.4.1.1 抗生素防治研究进展  19-20
      1.4.1.2 中药防治研究进展  20
    1.4.2 疫苗防治的研究进展  20-23
      1.4.2.1 灭活疫苗的研究进展  20-22
      1.4.2.2 弱毒疫苗的研究进展  22
      1.4.2.3 亚单位疫苗的研究进展  22-23
  1.5 鸭疫里氏杆菌外膜蛋白研究进展  23-26
    1.5.1 细菌外膜蛋白的简介  23-24
    1.5.2 外膜蛋白的结构及功能研究进展  24-25
    1.5.3 鸭疫里氏杆菌外膜蛋白的毒力研究进展  25
    1.5.4 鸭疫里氏杆菌外膜蛋白的免疫原性研究进展  25-26
  1.6 本研究的目的及意义  26-27
第二章鸭疫里氏杆菌的分离及鉴定  27-32
  2.1 材料  27-28
    2.1.1 病料来源  27
    2.1.2 主要试剂  27
    2.1.3 主要仪器  27-28
  2.2 方法  28
    2.2.1 细菌的分离培养  28
    2.2.2 分离株的理化鉴定  28
    2.2.3 分离株的血清型鉴定  28
  2.3 结果  28-30
    2.3.1 细菌的分离培养结果  28-29
    2.3.2 细菌理化鉴定结果  29-30
    2.3.3 血清型鉴定结果  30
  2.4 讨论  30-32
第三章鸭疫里氏杆菌的 PCR 诊断  32-44
  3.1 材料  32-34
    3.1.2 实验动物  32
    3.1.3 主要试剂  32-33
    3.1.4 主要仪器  33-34
  3.2 方法  34-37
    3.2.1 细菌的培养  34
    3.2.2 引物的设计与合成  34
    3.2.3 细菌 DNA 的提取  34-35
    3.2.4 PCR 反应体系及产物的测序  35
    3.2.5 PCR 特异性检测  35-36
    3.2.6 PCR 敏感性检测  36
    3.2.7 RA 分离株的 PCR 鉴定  36
    3.2.8 临床病料的诊断  36
    3.2.9 动物回归试验  36-37
      3.2.9.1 感染途径及感染剂量  36
      3.2.9.2 感染鸭的临床症状及剖检变化  36-37
      3.2.9.3 感染鸭的病原菌分离与鉴定  37
  3.3 结果  37-42
    3.3.1 RA 的 PCR 扩增及测序结果  37
    3.3.2 PCR 特异性检测结果  37-38
    3.3.3 PCR 敏感性检测结果  38-39
    3.3.4 RA 分离株检测结果  39
    3.3.5 RA 菌种的保存  39
    3.3.6 临床病料诊断结果  39-40
    3.3.7 动物回归试验结果  40-42
      3.3.7.1 临床症状  41
      3.3.7.2 剖检变化  41
      3.3.7.3 病原菌分离鉴定结果  41-42
  3.4 讨论  42-44
第四章鸭疫里氏杆菌分离株的抗药性试验  44-50
  4.1 材料  44-45
    4.1.1 菌株  44
    4.1.2 主要试剂及药敏纸片  44-45
  4.2 方法  45-46
    4.2.1 黄连汤的制备  45
    4.2.2 中药黄连汤药敏片的制备  45
    4.2.3 药敏试验  45-46
  4.3 结果  46-48
  4.4 讨论  48-50
全文结论  50-51
参考文献  51-60
附录  60-63
  附录一：缩写词英汉对照  60-61
  附录二：序列比对结果  61-63
作者简介  63-64
致谢  64

鸭疫里氏杆菌的分子诊断及抗药性研究

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