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石河子地区棉铃虫抗药性监测及CYP6AE14和AK基因的克隆

作　者: 武万锋
导　师: 张建华；赵伊英
学　校: 石河子大学
专　业: 农药学
关键词: 棉铃虫抗药性解毒酶细胞色素P450 精氨酸激酶
分类号: S435.622.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

棉铃虫[Helicoverpa armigera (Hiibner)]属于鳞翅目夜蛾科实夜蛾亚科棉铃虫属,是目前棉花生产的主要害虫之一,棉铃虫对杀虫剂的抗性是长久以来受到密切关注的重要问题。因此,经过调查,本实验利用丙溴磷、高效氯氰菊酯、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和赛丹4种常用杀虫剂对石河子地区的农试场、桃花镇、泉水地镇等3个试验点的棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hubner)种群采用FAO推荐的微量点滴法进行抗性测定。试验结果表明：石河子地区3个棉区棉铃虫种群均对高效氯氰菊酯产生了低水平抗性,抗性倍数分别为5.38倍、7.47倍、7.88倍；对赛丹、丙溴磷及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐3种药剂没有产生明显的抗性水平。同时,对石河子地区棉铃虫与敏感品系棉铃虫体内的几类主要解毒酶进行了酶蛋白的含量及比活力测定,以比较石河子地区棉铃虫与敏感品系棉铃虫酶蛋白含量及活性的差异,结果表明,石河子地区棉铃虫体内的多功能氧化酶的酶原含量及比活力均高于敏感品系棉铃虫且差异显著,而羧酸酯酶、磷酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶的酶原含量及比活力的差异性不显著。细胞色素P450氧化酶系是一类广泛分布于生物有机体中的重要酶系,它能够代谢多种内源性物质和外源性物质,因其生物学的重要性,一直是生物学领域研究的一个重要对象。为此,本实验对棉铃虫P450CYP6AE14基因进行了克隆和序列分析,并在原核细胞中进行了表达。根据已发表的棉铃虫CYP6AE14的基因设计出一对特异性引物,利用PCR的方法获得CYP6AE14的全长基因序列,该序列长1581bp,编码527个氨基酸,与陈晓雅老师测得的该基因序列对比中发现,石河子地区棉铃虫体内该基因碱基序列的第74、1059、1086、1113和1545位置上碱基与陈晓雅老师所测得相同位置的碱基是不同的,而在翻译编码的氨基酸序列中,只有第74位碱基对氨基酸的编码产生影响,由于遗传密码的简并性,其他4处碱基没有对编码的氨基酸产生影响。利用原核表达载体PET28-a在大肠杆菌中表达了棉铃虫细胞色素P450 CYP6AE14基因,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证P450蛋白质的表达,在50 kD左右出现诱导目的条带,为进一步的基因功能验证莫定了基础。在昆虫生命活动过程中,精氨酸激酶(Arginine kinase, AK)是其体内主要的磷酸原激酶,它通过催化精氨酸和ATP之间的可逆性反应,将能量存储于磷酸精氨酸的高能磷酸键中,或将磷酸精氨酸分解产生ATP,对昆虫体内的能量代谢、储存和利用起关键的调节作用。由于精氨酸激酶仅存在于无脊椎动物中,并且该酶及其磷酸原的能量代谢途径与哺乳动物中的完全不同,因此精氨酸激酶可以作为控制昆虫的一个很好的敏感靶标。为此,本研究对棉铃虫精氨酸激酶进行了克隆、表达,AK基因序列全长为为1068bp,编码355个氨基酸,分子量约为40 kD。将精氨酸激酶的基因连接到原核表达载体PET-28a上并转入大肠杆菌中进行原核表达。同时通过实时荧光定量PCR,得知AK基因在石河子地区棉铃虫体内的表达量比敏感品系棉铃虫体内AK基因表达量高77.36%。通过以上可以了解到,该酶是生物体内主要代谢类酶,如果精氨酸激酶(AK)基因在本实验研究对象即棉铃虫体内过量表达,那么将表明棉铃虫的生命代谢活动是非常旺盛的,随之将使棉铃虫在受到外源物质刺激时,增强对其代谢的能力,进而增强棉铃虫对其的抗性。因此,本研究对棉铃虫精氨酸激酶进行了克隆与表达,旨在为开发以精氨酸激酶为靶标的新型害虫抑制剂提供基础理论依据。

石河子地区棉铃虫抗药性监测及CYP6AE14和AK基因的克隆

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