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猪3种繁殖障碍性病毒多重PCR检测方法的建立

作　者: 程亮亮
导　师: 朱良强
学　校: 安徽农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 多重PCR 猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒猪伪狂犬病病毒
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 21次
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和猪伪狂犬病(PR)是影响养猪业发展的两种重要的传染病，而引起这两种疾病的病原就是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)。这三种病毒均是引起猪繁殖障碍性疾病的重要病原体，且在临床上多发生混合感染，虽然运用常规的病原学和血清学诊断方法也可区分此类症状相似的疾病，但这些常规方法却存在操作繁杂，耗时长，敏感性低等不足，难以用于混合感染时两种疫病的早期快速诊断。许多学者相继建立了检测PRRSV、HP-PRRSV和PRV的PCR技术，但同时鉴别检测这3种病毒的多重PCR方法还未见报道。因而，本试验建立了一种能够快速、准确、有效的检测PRRSV、HP-PRRSV和PRV的多重PCR方法，并应用该方法对送检的120份临床病料进行了检测。1PRRSV、HP-PRRSV和PRV多重PCR方法的建立根据GenBank中登录的PRRSV、HP-PRRSV的Nsp2基因缺失区序列信息及PRV的gB基因保守区序列，利用Primer Premier5.0和DNAStar软件分别设计并合成了2对特异性扩增引物，扩增目的片段长度分别为319bp、232bp、383bp。在成功建立单项PCR的基础上，通过对模板浓度、酶浓度及引物混合液浓度等条件的优化，先进行了HP-PRRSV和PRV双重PCR的建立；而后在双重PCR的基础上，通过调整PRRSV模板的添加量和同时扩增PRRSV、HP-PRRSV的引物混合液用量，最终建立起能够同时鉴别检测PRRSV、HP-PRRSV和PRV的多重PCR诊断方法。该方法具有良好的特异性，敏感性试验表明，该方法能检测出3种病毒的最低模板量分别约为2.48ng、2.22ng和0.44ng。2PRRSV、HP-PRRSV和PRV多重PCR方法的初步应用利用已建立的PRRSV、HP-PRRSV和PRV多重PCR方法对安徽省部分地区送检的120份临床病料进行了检测，结果显示，检出PRRSV阳性样品23份，HP-PRRSV阳性样品71份，PRV阳性样品40份，总阳性检出率分别为19.2%、59.2%、33.3%。其中，混合感染PRRSV和HP-PRRSV的样品有8份，占总数的6.7%；混合感染HP-PRRSV和PRV的样品22份，占总数的18.3%；混合感染PRRSV、HP-PRRSV和PRV的样品15份，占总数的12.5%。由此说明，送检病料中以HP-PRRSV感染为主，且发生混合感染。以上研究表明，本试验建立的多重PCR方法具有快速、特异、敏感的特点，能够应用于PRRSV、HP-PRRSV和PRV单一感染或混合感染的临床鉴别检测。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-10
文献综述  10-19
主要技术路线  19-20
引言  20-21
1 材料与方法  21-30
  1.1 材料  21-23
    1.1.1 病毒及细胞  21
    1.1.2 病料收集  21
    1.1.3 主要试剂及配制  21-22
    1.1.4 仪器设备  22
    1.1.5 引物设计  22-23
  1.2 方法  23-30
    1.2.1 病毒增殖  23
    1.2.2 PRV 的 DNA 提取  23
    1.2.3 PRRSV 和 HP-PRRSV 的 RNA 提取  23-24
    1.2.4 PRRSV 和 HP-PRRSV 的 cDNA 合成  24
    1.2.5 单项 PCR 扩增方法的建立  24-27
    1.2.6 单项 PCR 产物的回收鉴定  27
    1.2.7 多重 PCR 扩增方法的建立  27-28
    1.2.8 PRRSV、HP-PRRSV 和 PRV 三重 PCR 特异性试验  28
    1.2.9 PRRSV、HP-PRRSV 和 PRV 三重 PCR 敏感性试验  28-29
    1.2.10 PRRSV、HP-PRRSV 和 PRV 三重 PCR 重复性试验  29
    1.2.11 三重 PCR 方法检测临床猪组织病料  29-30
2 结果  30-40
  2.1 单项 PCR 退火温度的确定  30-31
  2.2 单项 PCR 反应条件的优化  31-33
    2.2.1 酶浓度的优化  31
    2.2.2 引物浓度的优化  31-32
    2.2.3 Mg＋浓度的优化  32-33
  2.3 PCR 产物鉴定  33-34
    2.3.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定  33-34
    2.3.2 测序结果  34
  2.4 HP-PRRSV 和 PRV 双重 PCR 的建立  34-36
    2.4.1 双重 PCR 反应中模板比例的确定  34-35
    2.4.2 双重 PCR 反应中酶浓度的确定  35
    2.4.3 双重 PCR 反应引物浓度的确定  35-36
  2.5 三重 PCR 反应的建立  36-37
    2.5.1 三重 PCR 反应中 PRRSV 模板量的确定  36-37
    2.5.2 三重 PCR 引物浓度的优化  37
  2.6 三重 PCR 特异性试验  37-38
  2.7 三重 PCR 敏感性试验  38
  2.8 三重 PCR 重复性试验  38
  2.9 三重 PCR 方法的临床应用  38-40
    2.9.1 临床病料中 PRRSV、HP-PRRSV 和 PRV 检测  38-39
    2.9.2 临床病料中 PRRSV、HP-PRRSV 和 PRV 混合感染检测  39-40
3 讨论  40-43
  3.1 多重 PCR 检测方法的建立及临床应用  40-43
    3.1.1 多重 PCR 的引物设计  40
    3.1.2 多重 PCR 反应条件的优化  40-41
    3.1.3 多重PCR的临床应用  41-43
结论  43-44
参考文献  44-48
致谢  48-49
作者简历  49
附研究生期间的发表论文  49

猪3种繁殖障碍性病毒多重PCR检测方法的建立

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