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华东地区部分猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

作　者: 张战峰
导　师: 方维焕
学　校: 浙江大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因型 RT-PCR鉴别检测 分子流行特征
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)又称“蓝耳病”,以引起猪呼吸道感染、仔猪死亡、母猪繁殖障碍等临床表现为特征。该病的病原为PRRSV,其为一种有囊膜的单股正链RNA病毒,属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属。与所有的RNA病毒一样,PRRSV具有高度的变异性,其中ORF5基因在PRRSV整个基因组中变异最大,因此,对ORF5基因变异分析在一定程度上可以反映出整个病毒基因组序列变异情况。PRRSV可分为两种基因型即美洲型和欧洲型。迄今为止,我国学者应用RT-PCR建立了很多针对PRRSV美洲型毒株检测方法而针对PRRSV美洲型和欧洲型毒株同时进行鉴别检测方面还未见报道,并且我国PRRSV分离株在基因型上均被鉴定为美洲型毒株,还未见欧洲型PRRSV分离株的报道。本研究旨在建立美洲型与欧洲型PRRSV的RT-PCR鉴别检测方法。并应用该方法对2004-2006年华东地区部分猪场猪疑似PRRS的组织病料进行检测,对检测为美洲型和欧洲型PRRS阳性组织病料扩增PRRSV ORF5基因,测序分析ORF5基因变异特征,以探明华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学情况。研究结果如下：参考VR-2332株和Lelystad株核苷酸序列,在N基因前后的保守区设计三条引物,建立了能够鉴别美洲型与欧洲型PRRSV的RT-PCR检测方法,特异性扩增片段长度分别为382bp(包括部分N基因)和576bp(包括整个N基因)。通过对美洲型和欧洲型PRRSV疫苗毒株以及两种疫苗株混合样本的检测,证明该方法不仅能够分别扩增出特异性的核酸片段,同时还可从基因水平上区分美洲型和欧洲型PRRSV。应用该方法对168份不同年份和地区的疑似PRRS组织病料进行检测,发现42份为美洲型PRRSV阳性,6份为欧洲型PRRSV阳性,1份为美洲型与欧洲型PRRSV混合阳性。代表性4株美洲型PRRSV与PRRSV-US、VR-2332毒株部分ORF7基因序列同源性在94.0%-95.3%之间；6份欧洲型阳性组织病料与PRRSV-EU的ORF7基因序列同源性分别在93.6%-99.7%之间,而与LV参考毒株(M96262)的ORF7基因序列同源性在95.1%-96.6%。根据发表的VR-2332和Lelystad ORF5基因序列设计两对特异性引物,对华东地区部分猪场的42个美洲型和7个欧洲型PRRSV毒株ORF5基因进行RT-PCR扩增,特异性扩增片段长度分别为723bp和702bp,将扩增的目的片段克隆于pMD18-T载体。序列测定结果表明：组织病料中23株美洲型(代表株)PRRSVORF5基因序列之间同源性分别为90.4%-99.5%(核苷酸)和88.1%-99.5%(氨基酸),而与VR-2332分别为87.1%-88.7%和86.1%-90.0%,这说明华东地区部分猪场流行的美洲型PRRSV毒株在ORF5基因区域的变异较大,与VR2332在分子水平上有一定的差距。5株欧洲型PRRSV ORF5基因序列((04TZ、04NB、04NB、04NB.04NB与疫苗株PRRSV-EU同源性分别为98.3%-98.5%(核苷酸)和96.0%-96.5%(氨基酸),而与Lelystad株分别为92.7%-93.2%和91.1%-91.6%,推测这5株欧洲型PRRSV可能来源于PRRS V-EU(AMERV AC-PRRS)。另2株欧洲型PRRSV GP5基因序列(06JS.06HZ)与疫苗株PRRSV-EU同源性分别为87.6%(核苷酸)和90.1%(氨基酸),而与Lelystad分别为87.3%(核苷酸)和88.6%(氨基酸),推测这两株欧洲型PRRSV可能来源于欧洲型PRRSV其他野毒株或其他的未知疫苗株。将本研究获得的23个美洲型PRRSV毒株的ORF5基因核苷酸序列与国内外已发表的21株美洲型PRRSV进行比较。2006年部分来自河南、河北、江西和江苏的分离株和同年的浙江株均在同一亚群Ⅰ。而2000年之前的国内外毒株则基本上分属于亚型Ⅲ和Ⅳ,如CH-la、MD001、S1、BJ-4、PL97-1、Kitasatp93-1等,这些毒株与早期典型美洲型PRRSV毒株(VR-2332)和疫苗株(PRRSV-US、RespPRRS MLV)的亲缘关系较近。初步表明国内2006年以来出现的PRRSV正在逐渐发生变异,在基因型上明显偏离早先的毒株。对7个欧洲型PRRSV分离株与9株欧洲型PRRSV分析结果显示：欧洲型可以分为3个亚群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、)。2004年组织病料中欧洲型PRRSV毒株[29(04TZ)、34(04NB)、42(04NB)、45(04NB)、57(04NB)]属于亚群Ⅰ,与PRRSV-EU、Pyrsvac疫苗株亲源关系较近。而2006年组织病料中欧洲型PRRSV毒株[(06JS)、HZ(06HZ)]属于亚群Ⅲ,与PRRSV-EU、Pyrsvac疫苗株亲缘关系较远,而与野毒株的亲缘关系较近。本研究建立了可以区分PRRSV美洲型和欧洲型的RT-PCR检测方法,分析了华东地区部分猪场猪组织病料中30株PRRSV(23株美洲型PRRSV、7株欧洲型PRRSV) PRRSV的遗传变异特征,提示欧洲型PRRSV可能在华东地区一些猪场中存在,丰富了我国PRRSV的分子流行病学资料,为PRRS的防治提供一定的参考依据。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-13
第一部分 文献综述  13-30
  第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒病原学研究  14-23
    1 一般特性和分类地位  14-15
    2 培养特性  15-16
    3 分子生物学特征  16-20
      3.1 基因组结构  16-17
      3.2 主要蛋白及功能  17-19
      3.3 遗传变异与抗原多样性  19-20
    4 发病机制  20-21
    5 分子流行病学  21-23
  第二章 猪繁殖与呼吸综合征诊断与控制技术研究  23-30
    1 猪繁殖与呼吸综合征诊断  23-27
      1.1 临床症状与病理变化  23-24
        1.1.1 临床症状  23-24
        1.1.2 病理变化  24
      1.2 病原的检测  24-26
        1.2.1 病毒分离  24-25
        1.2.2 病毒抗原检测  25
        1.2.3 分子生物学诊断  25-26
      1.3 血清学诊断  26-27
        1.3.1 免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)  26
        1.3.2 间接荧光抗体试验(IFA)  26
        1.3.3 血清中和试(SN)  26-27
        1.3.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)  27
    2 猪繁殖与呼吸综合征控制技术  27-30
      2.1 免疫预防  27-28
      2.2 综合防治  28-30
第二部分 实验内容  30-60
  第一章 美洲型与欧洲型PRRSV的RT-PCR鉴别检测方法的建立  31-42
    摘要  31-32
    1 材料与方法  32-37
      1.1 PRRSV弱毒疫苗毒株  32
      1.2 组织病料的采集  32-33
      1.3 主要试剂  33
      1.4 引物设计与合成  33-34
      1.5 病毒RNA的提取  34
      1.6 RT-PCR  34-35
        1.6.1 反转录(RT)  34
        1.6.2 PCR  34-35
      1.7 PRRSV弱毒疫苗毒株的RT-PCR鉴别检测  35
      1.8 RT-PCR检测PRRSV核酸的特异性  35
      1.9 PCR产物的克隆  35-37
        1.9.1 PCR产物的纯化  35-36
        1.9.2 感受态细胞的制备  36
        1.9.3 pMD18-T载体与纯化PCR产物的连接反应  36-37
        1.9.4 连接产物的转化与蓝白斑筛选阳性克隆  37
        1.9.5 PCR鉴定  37
    2 结果  37-40
      2.1 PRRSV-US和PRRSV-EU以及疫苗混合样本的RT-PCR鉴别检测  37-38
      2.2 RT-PCR检测PRRSV核酸的特异性  38
      2.3 组织病料中PRRSV的RT-PCR鉴别检测  38
      2.4 PCR产物测序及序列分析  38-40
    3 讨论  40-42
  第二章 华东地区部分猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查  42-60
    摘要  42-43
    1 材料与方法  43-48
      1.1 PRRSV毒株  43
      1.2 载体和菌种  43-45
      1.3 主要试剂  45
      1.4 病料的采集  45-46
      1.5 引物设计与合成  46-47
      1.6 病毒RNA的提取  47
      1.7 RT-PCR  47
        1.7.1 反转录(RT)  47
        1.7.2 PCR  47
      1.8 PRRS阳性组织病料中PRRSV ORF5基因的扩增  47
      1.9 PCR产物的测序  47-48
      1.10 序列分析  48
    2 结果  48-57
      2.1 PRRS阳性组织病料中PRRSV ORF5基因的扩增与测序  48
      2.2 PRRSV ORF5基因序列同源性分析  48-50
      2.3 浙江省部分猪场美洲型PRRSV毒株遗传进化关系  50-51
      2.4 浙江省部分美洲型PRRSV毒株与国内外PRRSV毒株遗传进化关系  51-53
      2.5 华东地区部分猪场欧洲型PRRSV毒株遗传进化关系  53
      2.6 华东地区部分猪场PRRSV ORF5基因编码的氨基酸变异分析  53-57
    3 讨论  57-60
结论与建议  60-61
参考文献  61-67
附录 常用试剂及缓冲液  67-73
致谢  73

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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