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鸡let-7a的组织表达、功能预测及其靶基因ADIPOR2遗传效应分析

作　者: 王乐乐
导　师: 康相涛
学　校: 河南农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: let-7a 组织表达谱 功能预测 脂联素受体2基因（ADIPOR2） 单核苷酸多态性(SNPs)
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


let-7家族是最早被发现的在物种间高度保守的广泛性表达miRNA，在肿瘤细胞的增殖、分化、脂肪生成及药物敏感性等方面发挥重要调控作用。前期我们采用Solexa高通量测序技术构建了固始鸡1日龄和36周龄两个发育阶段下丘脑的miRNA表达谱，分析发现let-7家族的8个成员在鸡下丘脑发育过程均呈高丰度差异性表达，尤其是let-7a，这表明let-7家族的miRNA在鸡下丘脑发育过程可能发挥重要调节作用。但目前有关鸡let-7a功能的研究尚未见报道。本研究采用实时定量PCR检测了let-7a在固始鸡14日龄胚胎、17日龄胚胎、1日龄雏鸡和36周龄成年鸡的13种不同组织中的表达情况；利用两种算法预测了let-7a的靶基因，并对共有靶基因进行了GO富集分析和KEGG通路分析；根据生物信息学分析结果，利用实验室固始鸡-安卡鸡资源群体素材，探讨了let-7a靶基因脂联素受体2Adiponectin receptor2（ADIPOR2）的遗传效应，分析了该基因的时序表达特征及其SNP与鸡生产性状间的关联性，主要结果如下：1.let-7a在所检测的组织中呈广泛性表达，其在下丘脑中的表达趋势与高通量测序结果一致；但组织间的表达量却存在较大的差异。14日胚龄和17日胚龄时，在脑组织和内脏组织中表达量均较高；1日龄时，let-7a在下丘脑、小脑、胸肌、肌胃和肾脏等组织中高丰度表达，在肺中低丰度表达，其它组织中适度表达；36周龄时，let-7a在各组织中的表达量均相对较低。2.对let-7a的107个预测的靶基因进行了GO富集分析和KEGG通路分析，结果显示靶基因主要在生物学过程调节相关的生物学过程中富集，尤其是与矿物质和磷代谢相关的调节过程；且在粘着斑、细胞外基质受体互作、MAPK信号通路等3个通路中显著富集(P<0.01)。3.let-7a预测的靶基因ADIPOR2在鸡不同生长阶段不同组织中广泛性表达。随着生长发育，ADIPOR2在大脑和肌胃两种组织中的表达水平与let-7a的表达水平变化趋势是相反的；在肺中，两者表达水平变化趋势一致；但在肾脏和小脑等其它10种被检测的组织中，两者表达水平的变化趋势没有呈现明显的对应关系。这些结果表明，let-7a和ADIPOR2基因在大脑和肌胃发育过程存在潜在的互作关系。4.对let-7a潜在靶基因ADIPOR2的SNP关联分析结果表明，g.34490C>T突变与肝脏重和血液球蛋白显著相关（P <0.05），g.35363T>C与6、10和12周龄体重显著相关（P <0.05），这两个多态都没有明显影响与脂肪相关的性状。g.34490C>T位点对相关性状具有显著的加性效应（P<0.05），g.35363T>C位点对显著相关的屠体性状具有显著的显性效应（P <0.05）。

全文目录


致谢  4-5
项目资助  5-11
摘要  11-12
1 文献综述  12-21
  1.1 miRNA 的简介和鉴定  12
    1.1.1 miRNA 的发现  12
    1.1.2 miRNA 的鉴定  12
  1.2 miRNA 调控基因表达的机制  12-13
    1.2.1 翻译抑制  12-13
    1.2.2 miRNA 介导 mRNA 降解  13
    1.2.3 SG(Stress Granules)颗粒  13
  1.3 miRNA 的表达调控  13-14
    1.3.1 RNA 编辑  13
    1.3.2 特异性增强子介导  13-14
  1.4 miRNA 的功能  14-15
    1.4.1 miRNA 调控动物的发育时序  14
    1.4.2 miRNA 调控细胞的分化、增殖与凋亡  14
    1.4.3 miRNA 在动物脂肪代谢中的功能  14
    1.4.4 miRNA 与病毒感染宿主动物  14-15
  1.5 miRNA 表达检测  15-16
    1.5.1 高通量测序  15
    1.5.2 实时定量 PCR 技术  15-16
    1.5.3 Northern blot 分析  16
  1.6 miRNA 靶基因的研究  16-17
    1.6.1 miRNA 靶基因的生物信息学预测  16-17
    1.6.2 miRNA 靶基因的鉴定  17
  1.7 let-7a  17-18
    1.7.1 let-7a 简介  17
    1.7.2 let-7a 的表达特征  17
    1.7.3 let-7a 的功能  17-18
  1.8 靶基因遗传效应的研究  18-19
    1.8.1 单核苷酸多态性(SNPs)  18
    1.8.2 SNPs 检测方法  18-19
  1.9 脂联素受体 2  19-21
    1.9.1 脂联素受体 2 的发现、结构、功能  19
    1.9.2 脂联素受体 2 的表达  19-21
2 引言  21-22
3 鸡 let-7a 的组织表达谱和生物信息学分析  22-32
  3.1 试验材料  22
    3.1.1 试验样品  22
    3.1.2 主要试验试剂及溶液配制  22
    3.1.3 试验仪器  22
  3.2 试验方法  22-24
    3.2.1 总 RNA 提取  22-23
    3.2.2 RNA 质量的检测  23
    3.2.3 实时荧光定量 PCR  23
    3.2.4 let-7a 标准曲线制作和绝对定量  23
    3.2.5 靶基因预测  23-24
  3.3 结果与分析  24-29
    3.3.1 RNA 质量的检测  24
    3.3.2 let-7a 实时定量 PCR 检测试剂盒的特异性  24
    3.3.3 let-7a 标准曲线  24-25
    3.3.4 let-7a 的绝对定量与组织表达谱  25-26
    3.3.5 let-7a 靶基因的生物信息学分析  26-29
  3.4 讨论  29-31
    3.4.1 关于实时定量 PCR 技术  29
    3.4.2 let-7a 的组织表达分析  29
    3.4.3 let-7a 功能分析  29-30
    3.4.4 脂源性细胞因子通路  30
    3.4.5 生物信息学预测靶基因的准确性  30-31
  3.5 小结  31-32
4 let-7a 与其靶基因 ADIPOR2 在鸡不同组织中表达关系的研究  32-37
  4.1 试验材料  32
    4.1.1 试验样品  32
    4.1.2 主要试验试剂及溶液配制  32
    4.1.3 试验仪器  32
  4.2 试验方法  32-34
    4.2.1 总 RNA 提取  32
    4.2.2 RNA 质量的检测  32
    4.2.3 反转录  32-33
    4.2.4 cDNA 质量的检测  33
    4.2.5 荧光定量 PCR 引物设计  33
    4.2.6 荧光定量 PCR 反应操作步骤  33
    4.2.7 数据处理  33-34
  4.3 结果与分析  34-36
    4.3.1 cDNA 质量及引物特异性检测  34
    4.3.2 ADIPOR2 在鸡不同发育阶段各组织中的表达  34-35
    4.3.3 ADIPOR2 与 let-7a 在各组织中的表达关系分析  35-36
  4.4 讨论  36
    4.4.1 鸡 ADIPOR2 基因组织表达特征  36
    4.4.2 ADIPOR2 基因与 let-7a 的表达关系  36
  4.5 小结  36-37
5 let-7a 潜在靶基因 ADIPOR2 的遗传变异研究  37-50
  5.1 试验材料  37-38
    5.1.1 DNA 样  37
    5.1.2 屠宰指标数据  37-38
    5.1.3 试验主要试剂与溶液配制  38
    5.1.4 主要仪器  38
  5.2 试验方法  38-41
    5.2.1 DNA 混池的构建  38
    5.2.2 筛选 SNP 位点  38-39
    5.2.3 酶切引物及内切酶的选择  39-40
    5.2.4 PCR 扩增  40
    5.2.5 PCR 产物的检测  40
    5.2.6 PCR 产物的酶切反应  40
    5.2.7 酶切产物的检测  40
    5.2.8 测序验证  40
    5.2.9 统计分析  40-41
  5.3 结果与分析  41-48
    5.3.1 鸡 ADIPOR2 基因筛选突变结果  41
    5.3.2 鸡 ADIPOR2 基因各突变位点 PCR 扩增结果  41
    5.3.3 鸡 ADIPOR2 基因 g.34490C>T 位点酶切结果与分析  41-42
    5.3.4 鸡 ADIPOR2 基因 g.35363T>C 位点酶切结果与分析  42
    5.3.5 群体样本含量、基因型频率及等位基因频率分析  42-43
    5.3.6 群体遗传特性分析  43
    5.3.7 ADIPOR2 基因 SNP 位点与生产性状的关联分析  43-45
    5.3.8 ADIPOR2 基因加性效应与显性效应分析  45-48
  5.4 讨论  48-49
    5.4.1 ADIPOR2 基因 g.34490C>T 位点关联分析  48
    5.4.2 ADIPOR2 基因 g.35363T>C 位点关联分析  48-49
    5.4.3 ADIPOR2 的 SNP 对 miRNA 的影响  49
  5.5 小结  49-50
6 结论及需进一步研究的内容  50-51
  6.1 结论  50
  6.2 需进一步开展的工作  50-51
参考文献  51-57
ABSTRACT  57-58

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家禽 > 鸡
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